Sw-5bM5突变体转基因烟草的获得开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄斑萎病毒属（tospovirus）是布尼亚病毒科（bunyaviridae）中唯一侵染植物的病毒属，番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, tswv)是番茄斑萎病毒属中的重要成员[1]。

且不同种番茄斑萎病毒属病毒的寄主范围差异很大，具有种类的多样性[2]。

番茄斑萎病毒基因组为负单链rna（-ssrna），分别为s、m 和l rna，其中m rna正义链编码的非结构蛋白nsm 是唯一一个布尼亚病毒科的其它动物病毒所不能编码的蛋白，被认为是tospoviruses适应植物的结果。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标： 通过获得sw-5bm5突变体转基因烟草来研究该突变位点对sw-5b的抗性的影响。

研究内容： （1）植物表达载体p2300-sw-5bm5的构建；（2）利用叶盘法将p2300-sw-5bm5导入到本氏烟中；（3）对to代植株进行hr筛选，阳性植株收种后培育t1代植株；（4）对t1代接种tswv，进行抗性鉴定。

拟解决的关键问题：（1）获得转sw-5bm5的t0代植株；（2）获得稳定表达sw-5bm5的t1代植株；（3）确定m5对sw-5b抗性的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法：（1）利用分子克隆的方法构建植物表达载体p2300-sw-5bm5；（2）通过电击转化的方法将p2300-sw-5bm5转到农杆菌gv3101；（3）通过叶盘法获得转sw-5bm5的t0代本氏烟；（4）在t0代植株的叶片上瞬时表达nsm，对产生hr的植株进行收种；（5）在t1代植株上接种tswv，进行抗性鉴定。

技术路线：构建p2300-sw-5bm5载体通过烟草叶盘法将sw-5bm5导入本氏烟获得t1代植株病进行抗性鉴定实验方案：（1）研究材料：本实验需要的研究材料有本氏烟、植物瞬时表达载体p2300、大肠杆菌（escherichia coli）dh5α、农杆菌gv3101 感受态细胞等。

研究需要的药剂有各种酶和生化药剂,植物激素bmp、naa,抗生素等。

4. 研究创新点

单显性基因 Sw-5b 对番茄斑萎病毒属病毒具有广谱抗性，它通过识别 NSm 来诱导过敏性坏死反应从而防止病毒入侵。

而本项目研究的是Sw-5b 基因的突变体Sw-5bM5突变体，该突变体不同于其他，其突变位点变化最大，除了氨基酸的差异外还少了一个Y，识别NSm的能力减弱，我们希望通过Sw-5bM5突变体转基因烟草的获得来研究该突变位点是否对Sw-5b的抗性产生影响。

5. 研究计划与进展

项目研究计划：①2017年9月-10月 学习基本实验操作和一些分子生物学的技术，了解相关背景知识。

阅读文献，收集相关番茄斑萎病毒及抗性蛋白sw-5b 与nsm的分子识别机制的资料，整理资料内容。

②2017年10月-2018年2月 学习烟草叶盘法转基因技术，将sw-5bm5基因转入烟草叶片中，首先将叶片置于共生培养基上培养，两天后转入出芽培养基上培养。