柳枝稷PvPIP2;1基因的克隆与表达分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

柳枝稷(panicum virgatum l.)为美洲的本土植物，隶属禾本科黍属，是一种多年生暖季型草本植物，通常被用于水土保持、放牧以及生态建设等^[1]。柳枝稷的株高在50~250cm范围内，寿命比较长，一般在 10 年以上。与传统作物相比，柳枝稷的抗旱能力强，需肥量少，虫害少，产量高，最高产量可达 74.1 t/hm²。国内外许多学者认为柳枝稷是一种具有较大发展潜力的能源作物^[2]。其不仅具有强适应能力，还有较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊薄能力，并且对环境友好，作为一种具有较大发展潜力的能源作物受到关注。近年来, 国际上将其作为一种新型能源模式作物进行了深入研究, 用于火力发电, 以木质纤维素生产乙醇, 还可用于造纸和进行生态环境保护。能源危机使生物能源在全球掀起了研究高潮, 美国对于柳枝稷尤为重视^[3-4]。

能源植物不能与粮争地，因此需要重复利用边际地和退化土地。为了进一步提高柳枝稷对边际和退化土地的适应能力，提高其生物产量，有必要进一步增强其抗逆性。处于逆境中的植物，体内会发生一系列的生理生化反应来应答和耐受逆境^[5]。首先，植物通过多种途径感应环境变化，然后将这种变化信息传递到细胞内部，细胞内部发生一系列磷酸化级联反应^[6]，将信号传递给转录因子，转录因子随后与顺式作用元件结合，启动抗逆基因的表达^[7]，从而提高植物的抗逆性。因此，分析植物的抗逆机理，克隆参与抗逆调控的相关基因，能够为抗逆分子育种的开展提供基础。

水通道蛋白(aquaporin,aqp)是一类从原核生物如细菌到人体和其他哺乳动物都广泛存在的细胞膜上水通透性蛋白, 能够选择性地高效跨膜转运水分子。与动物和微生物相比,植物水通道蛋白基因不仅具有丰富的多样性还呈现出极高的丰度。植物质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, pip)是水通道蛋白的亚类, 目前已发现的水孔蛋白中多数为pips。因与膜内在蛋白(membrane intrinsic protein, mip)序列同源性和结构相似性程度较高, 属于mip超家族^[8-9]。分子量在26-29kd之间,由5个短环相连的6个跨膜a-螺旋及伸入胞质的n端和c端组成。水孔蛋白的一级结构呈现出内部同源性,推测为是基因内部扩增而成。两个由3个氨基酸组成的结构域nap盒(aps-pro-ala box)高度保守,几乎存在于所有已知的水孔蛋白中,它们参与水通道的形成,对水孔蛋白的功能十分重要^[10-11]。实验表明pips在多个物种中具有运输水的功能。pips能够介导水分和中性分子的跨膜转运, 包括甘油、尿素、co₂等。此外, 还有研究表明pips与对植物氧化应激反应、损伤修复也起到一定作用。于是人们期望通过将pips基因转入农作物中并且表达,来提高作物的抗逆能力。最近也有研究发现pips在植物细胞生长方面能够起到促进的作用^[12]。植物在整个生命周期中, 经常受到各种环境因子的影响。环境压力所导致的光合作用减少、氧化损伤、激素变化及胁迫相关蛋白积累, 通常会导致植物组织脱水。当植物抵御干旱胁迫、盐胁迫和渗透胁迫时, 植物细胞的pips通过发生表达水平、蛋白活性和蛋白结构等不同的适应性改变, 从而发挥着重要的作用^[13]。

2. 研究的基本内容和问题

（1）研究目标

本研究利用从柳枝稷基因组信息库中得到的一系列水孔蛋白pips转录因子为研究起始，利用qrt-pcr技术分析此类基因在柳枝稷多种胁迫下的表达谱变化，筛选与胁迫有关的目标基因。结合race(rapid amplification of cdna ends) 技术，扩增并克隆目标基因全长，将其在模式植物烟草中过量表达，分析其是否能够提高植物的抗旱性，验证目标基因功能，为加快柳枝稷抗性育种提供理论基础。

（2）研究内容

3. 研究的方法与方案

（1）研究方法

①文献综述法

查阅文献，了解水通道蛋白基因的功能，归纳该类基因并进行生物信息学分析，找出该类基因的保守区序列。熟悉基因克隆技术及流程，掌握转基因技术。

4. 研究创新点

特色或创新之处

（1）本研究项目以柳枝稷为研究对象，目前有关柳枝稷抗逆基因挖掘研究较少；本项目率先在柳枝稷克隆抗逆相关水孔蛋白基因，并进行功能验证。

（2）项目将进行各类生物信息学分析，为生物信息学学习提供了一个较好的平台。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

（1）2014.6~2014.7

熟悉各类生物信息学软件；基于est和转录组信息，检索柳枝稷水孔蛋白基因。