老鸦瓣鳞茎解除休眠过程淀粉粒显微结构观察开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的研究目的和意义

老鸦瓣tulipa edulis (miq.) baker为百合科郁金香属多年生草本植物，其干燥鳞茎入药为光慈姑，具有消肿、散结、化痰之功效。现多用于开发肿瘤的临床用药，致使其需求量大增。而目前老鸦瓣主要处于野生状态，且生长缓慢，繁殖系数低，给大规模生产带来不便。因此，采用其有性繁殖即种子繁殖的方法成为扩大生产的有效途径。在自然条件下，老鸦瓣的种子在4月底～5月初成熟，种子自脱落后直至翌年早春萌发出土，中间经历了8～9个月的休眠期。老鸦瓣种子在成熟时处于形态生理性休眠，需要低温贮藏解除休眠才能很好地萌发并进一步完成生长和发育。在低温贮藏期间，老鸦瓣的鳞茎中发生了重要的生理生化变化。研究这其中的变化有助于掌握老鸦瓣的休眠机理并对其休眠进行调控。

淀粉是鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形式^[1，2]，常以淀粉粒的形式存在于组织细胞中^[3]，细胞内淀粉粒的积累或消失反映了碳水化合物的代谢状况^[3,4]。作为细胞主要能量和碳架贮藏库的造粉体中贮藏的淀粉粒，其数量和形态的变化与植物发育和休眠密切相关。因此，研究鳞茎休眠打破原理离不开对淀粉粒的研究。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

通过对老鸦瓣鳞茎解除休眠过程中淀粉粒显微结构的观察，了解老鸦瓣在解除休眠过程中发生的生理生化变化，以期明确老鸦瓣休眠和解除机理。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

石蜡切片技术、显微观察。

供试材料为老鸦瓣鳞茎。一半置于(40.5)C的冰柜贮藏，另一半于室温下贮藏。分别于贮藏0、2、4、6、8、10周后取样，每次取样后用FAA固定液保存。直至6次取样结束，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡切片，切片后PAS染色，封片剂封片。在显微镜下观察淀粉粒，并照相。

在显微镜下对老鸦瓣鳞片细胞淀粉粒数进行统计，每个时期随机选择3张切片，随机5个视野，取平均值。

技术路线：

实验方案：

一、供试材料

供试材料为老鸦瓣鳞茎。待老鸦瓣植株地上部枯萎后收获鳞茎，选取鳞片抱合紧密、无病虫害、鳞茎盘无损伤，平均质量1克的鳞茎，清洗干净。

二、操作步骤

1.取样

净制好的老鸦瓣鳞茎一半置于(40.5) C的冰柜贮藏，另一半于室温下贮藏。分别于贮藏0、2、4、6、8、10周后取样。每次取样时，随机选取大小适中、无污染的老鸦瓣鳞茎，切成2*3mm的小块，用FAA固定液固定，并抽气。于4℃冰箱保存，直至6次取样结束。

2.冲洗

每个处理每个时期选择4个样，分别放到青霉素瓶中，标记好。→50%乙醇（20min）→50%乙醇（20min）→50%乙醇（2h）

3.脱水

→70%乙醇（2h，可过夜）→85%乙醇（2h）→95%乙醇（2h）→100%乙醇Ⅰ（40min）→100%乙醇 Ⅱ（40min）→100%乙醇 Ⅲ（40min）

4.透明

→二甲苯 纯酒精（2h）→纯二甲苯Ⅰ（1.5h）→纯二甲苯Ⅱ（1.5h）→二甲苯Ⅲ（40min）

5.浸蜡

→加2/3石蜡至石蜡不再融化为止→37℃过夜→纯蜡Ⅰ(60℃，2h)→纯蜡Ⅱ(60℃，2h)→纯蜡Ⅲ(60℃，2h)

6.包埋

→包埋入纸盒

7.切片、粘片

→蜡修成梯形，靠近木块的面比较大，待切面比较小→水盘法粘片

8.脱蜡、复水

→蜡片→二甲苯Ⅰ(3-10min)→二甲苯Ⅱ(3-10min)→二甲苯 纯酒精（3-10min）→100%酒精Ⅰ（3-5min）→100%酒精Ⅱ（3-5min）→95%酒精（2-5min）→85%酒精（3-5min）→70%酒精（3-5min）→50%酒精（3-5min）→35%酒精（3-5min）→蒸馏水（3-5min）

9.染色

→自来水冲洗（5min）→0.5%高碘酸(5-15min)→蒸馏水(3-5秒)→希夫试剂（15-30min）→漂洗液（3-5min/次*3次）→自来水冲洗（3-5min）

10.透明、封片

→35%酒精→50%酒精（3-5min）→70%酒精（3-5min）→85%酒精（3-5min）→95%酒精（2-5min）→100%酒精Ⅰ（3-5min）→100%酒精Ⅱ（3-5min）→二甲苯 纯酒精（3-10min）→二甲苯Ⅰ(3-10min)→二甲苯Ⅱ(3-10min)→封藏

11.镜检

→每个时期每个处理各选三张切片，每张切片随机五个视野，统计并算平均值→照相→得出结果、分析讨论

可行性分析：

实验设备齐全、所需试剂均常用。实验方法科学常规、操作安全简便，易得到数据。且可以在图书馆和网上了解相关石蜡切片制作的实验指导书，为实验进行提供了有力的指导。

4. 研究创新点

研究内容有创新。老鸦瓣的研究在当前市场还是一个很新的课题。目前关于其相关研究尚少，很多方面都有待开发研究。作者从这一角度，选取老鸦瓣的解除休眠过程为研究课题，选题新颖，有很大的市场发展空间。

研究方法有创新。从老鸦瓣鳞茎细胞中淀粉粒显微结构角度观察研究，了解其在解除休眠过程中的生理生化变化。从细胞学的角度了解老鸦瓣休眠与解除过程成分变化，不同于测量法的研究，从不同的角度对老鸦瓣进行研究。

5. 研究计划与进展

2013年5月初，确定研究课题，收集相关资料及实验操作方法。

2013年7月底至2013年10月初，供试材料的选取及预处理。

2013年10月底至2013年12月中旬，进一步收集、查阅关于相同或相近种属相关课题研究结果，完成文献综述。