不同发育阶段生殖细胞中CD9表达的检测和分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

CD9 是介导精卵质膜融合的一种重要的蛋白分子，它有多种生物学功能，CD9 是 TM4SF 的一个成员，为分子量约 22-28 kD 的细胞表面糖蛋白，广泛表达于多种组织中并参与多种细胞活动，如维系细胞黏着、调节细胞运动性、信号传导、免疫调节、细胞癌变等，但对其作用机制仍不清楚。同时，在精卵结合中也发挥重要作用，是大鼠和小鼠精原干细胞的表面标志物。CD9 虽然广泛表达于各种组织中，但在生殖细胞中表达与定位的深入研究很少，目前只有在 SD（Sprague-dawley）大鼠的精原干细胞、猪卵巢，以及小鼠精巢和精子及卵子上分布的报道，而在关于CD9在不同发育阶段小鼠的生殖细胞中的具体表达量还不清楚。[1].MIYADO K,YOASHIDA K,YAMAGATA K,etal.The fusing ability of sperm is bestowed by CD9-containing vesicles released from eggs in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105:12921-12926.[2].WANG JC,BEGIN LR,BERUBE NG,et al.Down-regulation of CD9 expression during prostate carcinoma progression is associat-ed with CD9 mRNA modifications[J].Clin Cancer Res,2007,13:2354-2361.[3].鄂尔浑塔娜,李莉.Wistar大鼠CD9的cDNA克隆、原核表达及生殖腺中的检测[J].生物技术通报,2011,12:145-148.

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

对cd9在小鼠不同发育阶段生殖细胞中的表达情况进行初步的分析

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1、组织包埋

2、组织切片制作

3、利用免疫组化检测CD9的表达情况

4、RT-PCR检测生殖细胞中CD9的表达

技术路线：

组织→组织包埋→切片制作→免疫组化

组织→组织包埋→切片制作→RT-PCR

实验方案：

1、组织包埋

分别将5日龄、10日龄、20日龄及42日龄的雄、雌小鼠各三只处死后取出卵巢和睾丸放入福尔马林液中，并置于水平摇床上过夜。过夜后的组织依次放入50%、70%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ、100%Ⅲ的ETOH中，每次45min；再依次放入透明剂Ⅰ、透明剂Ⅱ、透明剂Ⅲ中，每次45min；接着依次放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中，每次1hour，经过这一系列处理后即可进行组织包埋

2、切片制作

将经过包埋的组织置于石蜡切片机上，进行切片，切好的组织放入温水上，待3min后即可捞起置于载玻片上，晾干。

3、免疫组化

把处理过的组织玻片进行免疫组化，观察表达量的变化

5、RT-PCR

提取组织，进行RT-PCR检测

可行性分析:

在本次实验所使用的免疫组化检测是通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量研究的技术，该技术已经非常成熟；CD9 是介导精卵质膜融合的一种重要的蛋白分子，是大鼠和小鼠精原干细胞的表面标志物，以前国内外的研究成果奠定了该实验的基础。

4. 研究创新点

1、对CD9在不同发育阶段生殖细胞的表达情况有更好的资料积累，本次实验研究了5日龄、10日龄、20日龄及42日龄的雄、雌小鼠生殖细胞中CD9的表达。

2、本实验为研究CD9的生物学功能及其在组织的具体作用提供了基本实验支持，具有重要的生物学意义。

5. 研究计划与进展

2015年3月9号至2015年3月29号 组织的取样包埋

2015年3月30号至2015年4月30号 对组织进行免疫组化检测

2015年4月30号至2015年5月18号 完成数据整理和论文的撰写