团头鲂对维生素B12需求量的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.国内外研究概况

团头鲂(megalobrama amblycephala)，原产湖北省武昌县，俗称武昌鱼、鳊鱼，隶属鲤形目，鲤科，鳊亚科，鲂属。我国的鳊鱼类分为2个属，即鲂属和鳊属，3个种，即长春鳊、三角鲂和团头鲂。团头鲂是我国重要的草食性经济鱼类之一，由于其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，能在池塘中产卵繁殖，且具有味美、头小、含肉率高、体形好、规格适中等优点，因而被作为优良的草食性鱼类品种在全国普遍推广。近20年来,江苏、浙江、上海、安徽、山东、河南、河北、湖南、江西等20余个省、市、自治区引进养殖了团头鲂。目前团头鲂在南方地区产量约占总产量10%以上，成为我国池塘、网箱养殖的主要品种，经济效益非常显著。

维生素b₂，又称核黄素，属于水溶性b族维生素，在鱼类的生长发育过程中发挥重要作用，是黄素单核苷酸（fmn）和黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）的统称^[1]。fmn和fad在体内主要作为琥珀酸脱氢酶、脂酰辅酶 a 脱氢酶、谷胱甘肽还原酶等氧化还原酶的辅酶，催化机体许多重要氧化一还原反应，完成底物和黄素蛋白之间一个或两个电子的转移。黄素腺嘌吟二核苷酸与特定蛋白结合形成黄素蛋白酶，也能催化体内许多不同类型的反应，如脱氢反应，羟化反应、氧化脱羧反应和双加氧反应。这些反应都同蛋白质、脂肪和碳水化合物的代谢紧密相关^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

通过养殖试验确定团头鲂对维生素b₂的最适需要量。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

采用单因子浓度梯度法，用添加不同浓度梯度的维生素B₂的纯和饲料饲喂试验幼鱼，探讨不同水平维生素B₂对团头鲂幼鱼生长性能、体组成、消化代谢和抗氧化能力的影响，从而确定团头鲂对维生素B₂的需要量。

2.技术路线

（1）查阅资料，设计实验；

（2）据所查阅的资料设计饲料配方，并制作饲料；

（3）团头鲂幼鱼预饲一周，正饲八周；

（4）采集样品，测定指标；

（5）分析数据，攥写论文；

3.实验方案及可行性分析

（1）试验幼鱼及分组

幼鱼由中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场提供。试验选择健康、规格、重量基本一致团头鲂720尾，个体初重为2.01g左右。随机分为6组，维生素B₁₂添加量梯度为0、2、4、6、8、10mg/kg，每组设4个平行试验，每平行15尾试验鱼。养殖试验在室内进行，采用室内循环水族箱饲养。

（2）试验日粮

试验日粮为纯和日粮，酪蛋白、明胶作为蛋白源，玉米淀粉做糖源，鱼油和豆油做脂肪源，见表1，采用单因子维生素浓度梯度法，在配合料中分别添加维生素B₁₂浓度：0、2、4、6、8、10mg/kg，用纤维素填充。各种原料分别粉碎过60目筛，先把磷酸二氢钙、添加剂、混匀，再加大料逐级充分混匀，后加适量水，用小型制粒机制成粒2.0 mm的颗粒饲料，在避光条件下晾干备用。

表1 基础日粮组成及营养水平

（3） 日常管理

将幼鱼驯养一周后正式开始养殖试验。每日的8：00、12：00和16：00投饲，日投饵量为体重的3%～5%，具体投喂量根据实际情况而定。试验持续60d。饲养过程中每天8:00及16:00各测温一次，每周测一次水质。实验期间保持水温20-30℃、水体PH 7.5～8.0、溶养 ＞ 5.0mg/L、氨氮 ＜ 0.4mg/L、亚硝态氮 ＜ 0.06 mg /L、总氮 ＜ 1.5 mg /L、总磷 ＜ 0.8 mg /L。

（4）样品采集

试验结束时将鱼饥饿24h，每箱鱼称重并数出总数。每箱任取20尾鱼测量体长。任取10尾鱼冰冻保存以测定体组成。每箱任取5尾鱼进行麻醉（MS-222，浓度为1：2500），并抽取血液。每箱任取1尾鱼置于冰盘上解剖，取出内脏并去除头部以测定胴体率；将肠道取出，用0.85%的生理盐水清洗内容物，取中间1／3的肠道组织以测定消化酶的活性；分离肝胰脏并称重以测定肝体指数和代谢酶活性。

（5）测定指标与方法

①生产性能

计算各试验组的增重率（WGR）、存活率、特定生长率（SGR）、饵料系数（FCR）、肥满度（CF）、脏体比（VSI）、肝体指数（HSI）、胴体比（DP）、蛋白质效率比（PER）、 蛋白质保留率。

增重率 (Weight gain, WG, %) = 100 (Wt - W0) / W0

特定生长率 (Specific growth rate, SGR, % /d) = 100 [ln(Wt) - ln(W0)] /T

饵料系数 (Feed conversion ratio, FCR) = F / (Wt - W0)

蛋白效率比 (Protein efficiency ratio, PER) = (Wt - W0) / (F CP)

胴体率 (Dressout percentage, DP, %) = 100 空壳重 (g) / 体重 (g)

肥满度 (Condition factor, CF, %) = 100 体重 (g) / 鱼体全长 (cm)3

肝体比 (Hepatosomatic index, HSI, %) = 100 肝脏重 (g) / 体重 (g)

氮保留率 (Nitrogen retention efficiency, NRE, %) = 100 (Wt CPt W0 CP₀) / (F CP)

式中W₀为鱼体初重(g)；Wt为鱼体末重(g)；F为投饲量(g)；CP₀为试验开始时鱼体粗蛋白含量(%)，CPt为实验结束时鱼体粗蛋白含量(%)，CP为饲料中粗蛋白含量(%)，T为饲养天数(d)。

②体组成及肌肉组成

测定全鱼、胴体、肌肉和肝胰脏中的水分、粗蛋白（CP）、 粗脂肪（EE） 、粗灰分（Ash）的含量。以上参数的测定参照AOAC（1984）的方法：用105℃烘干至恒重测定样品水分；用FOSS凯氏定氮仪测定粗蛋白含量；用索氏抽提系统通过乙醚抽提失重法测定样品粗脂肪含量；用马福炉550℃高温灼烧法测定灰分含。

③消化酶活性的测定

Ⅰ.蛋白酶活力

采用福林-酚试剂法(Folin-phenol)测定。pH 7.5,底物酪蛋白质量浓度10 mg/ml，在40 ℃条件下，每分钟水解酪素产生相当于1μg酪氨酸所需的酶量，规定为一个酶活力单位。

Ⅱ.淀粉酶活力

采用碘-淀粉比色法测定。组织中每毫克蛋白在37 ℃与底物作用30分钟，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书操作。

Ⅲ.脂肪酶活力

采用脂肪酶试剂盒测定。每克组织蛋白在37 ℃与底物作用1分钟，每消耗1μmol底物为1个酶活力单位。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书操作。

④饲料和肝脏中维生素B₂含量

采用高效液相色谱-质谱联用检测法(Hyphenation of High Performance Liquid Chromatography and Mass Spectrometry，HPLC-MS)测定饲料和肝脏中维生素B₂的含量。

色谱柱: Agilent ZORBAX XDB-C18柱, 2.150mm, 3.5um, SN: USHP 003891；流速500μ L/min；柱温25℃；流动相A: 5 mmol甲酸铵 B:（ 0.1%甲酸）甲醇，梯度洗脱；进样量：10 uL。

梯度洗脱程序

质谱检测参数：

气帘气（Curtain Gas）: 20 psi

喷雾电压（IonSpray Voltage）: 5000 V

雾化温度（temperature）: 550 ℃

雾化气（Ion Source Gas1）: 60 psi

辅助气（Ion Source Gas2）: 60 psi

样品制备：取匀浆样品50ul, 加入200ul 10 ng/ml 的丁螺环酮(buspirone)内标溶液，再加入5uL甲醇，涡旋1min后，15000r/min 离心10min, 取上清100ul进样。

⑤肝脏中蛋白含量

肝脏蛋白含量的测定采用微量考马斯亮兰法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书操作。

⑥肝脏中乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性

采用双抗体夹心法测定肝脏中乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性。用纯化的团头鲂乙酰辅酶A羧化酶（ACC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙酰辅酶A羧化酶（ACC），再与HRP标记的乙酰辅酶A羧化酶（ACC）抗体结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品肝脏中乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性。试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司，按试剂盒说明书操作。

⑦肝脏中丙酮酸羧化酶（PC）活性

采用双抗体夹心法测定肝脏中丙酮酸羧化酶（PC）活性。用纯化的团头鲂丙酮酸羧化酶（PC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入丙酮酸羧化酶（PC），再与HRP标记的丙酮酸羧化酶（PC）抗体结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品肝脏中丙酮酸羧化酶（PC）活性。试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司，按试剂盒说明书操作。

⑧肝脏抗氧化指标

各酶活测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，MDA的单位定义为nmol/mg组织蛋白；谷胱甘肽（GSH）与谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）测定利用二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时产生的黄色化合物进行比色定量测定，规定为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）酶活力单位；过氧化氢酶（CAT）的测定方法为过氧化氢酶（CAT）分解过氧化氢反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的过氧化氢鱼钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其吸光度值，从而换算出CAT活力。

⑨血浆免疫指标

血清总蛋白、白蛋白、溶菌酶、碱性磷酸酶的测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。总蛋白采用考马斯亮兰法，白蛋白采用溴甲酚绿比色法，溶菌酶采用比浊法。

（6）数据统计及分析

试验数据采用平均值标准误表示，采用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析方法（One-way ANOVA）对数据进行方差分析，并用Duncan氏法对数据进行显著性检验，差异显著性水平设为P0.05。

4. 研究创新点

与以往通过测定某一动物对某种营养物质的需要量来估计、推算其他同属动物的需求量想比，本实验直接以团头鲂作为研究对象，其针对性更强，经过科学实验、合理分析得到的团头鲂对维生素B₂的需要量也会更为符合其客观需要量。

5. 研究计划与进展

1.养殖试验（9月1日- 10月25日）

2.样品采集（10月26日）

3.实验室试验（11月1日-12月15日）