miR-181a对热应激诱导的奶牛外周血淋巴细胞的调控作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1研究意义与前景

随着全球气候变暖，热应激对动物的影响日益加剧。我国南方夏季平均气温普遍偏高，长期以来，高温导致畜禽的热应激一直影响着农业的发展，给农业带来很大损失。其中高温导致的奶牛热应激一直影响着产奶量，给奶牛业带来很大损失。奶牛热应激的调控机制受多种因素如环境、营养、遗传等方面的调控。有关热应激对奶牛产奶量、乳品质、生理指标、采食量、消化率、血液激素水平、繁殖性能方面的研究已成为近年来的研究热点。研究表明，热应激对奶牛的多数免疫指标也有重要影响^[1]。

微小rna(microrna,即mirna)通过与靶mirna特异性的碱基配对,引起靶mirna的降解或者抑制其翻译,从而发挥基因转录后调节功能^[2-3]。mirna分子广泛参与到调控细胞生长、发育、分化及凋亡的各个环节 ^[4-5]，并与动物生理状态的改变以及疾病的发生、发展密切相关^[6-7] 。mirna在哺乳动物泌乳过程中也起着重要的作用^[8-9]。有研究表明，高温可能通过改变奶牛外周血中某些功能性mirna的表达，从而调控与奶牛泌乳性状相关的功能基因和信号通路，进而影响奶牛产奶量和乳品质^[10]。

2. 研究的基本内容和问题

本研究试验所用动物为成年荷斯坦奶牛(南京西岗奶牛场)。采取尾静脉采血，肝素钠抗凝，经 Ficoll 密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，实验分为对照组，热应激组，以及热应激 转染组三组进行，miR-181a对高温诱导的外周血淋巴细胞的生长和凋亡的调控作用。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

采取奶牛尾静脉采血，肝素钠抗凝，经 ficoll 密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞并对其进行培养。分为三组进行对照实验，即正常组，热应激组（41下培养1h），热应激 转染组(转染后6h，在进行41培养1h，恢复6h) ，收集细胞，进行mtt成活率检测，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞检测mda、sod的含量，经trizol提取rna并反转录成cdna，荧光定量pcr检测bax、bcl-2的基因表达。

2 技术路线

4. 研究创新点

与组织活体和屠宰取样相比，采血具有减轻取样过程对奶牛损伤应激等优点，并且由于目前对奶牛血清中miRNA对淋巴细胞的作用机制鲜有报道，本研究以奶牛外周血淋巴细胞作为实验材料，通过转染miR-181a的抑制剂的方式抑制miR-181a的表达，探索miR-181a对高温环境下淋巴细胞的影响，本实验具有一定创新与特色。

5. 研究计划与进展

2014年7月至2014年9月 查阅相关文献，设计实验方案；

2014年10月至2014年11月 练习细胞培养，学习实验仪器的使用，掌握所需实验技术。

2015年12月至2015年4月 完成全部主体实验，整理结果及数据分析等一系列工作。