猪去脂胚胎的冷冻及优化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题意义：猪卵母细胞及其早期胚胎含有较多的脂滴，许多研究证实了猪卵母细胞与胚胎对低温的敏感与其高脂肪含量相关。

当温度低于0℃时，大量的脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解，同时，由于脂滴含量的变化，不同发育阶段猪胚胎冷冻保存的敏感性不同，发育阶段越早，其冷冻耐受力越低。

所以去脂可使猪胚胎获得对冷冻的耐受力。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标：本研究以体外成熟卵子经孤雌激活所获胚胎为研究模型，试图在现有Cryotop的玻璃化冷冻技术的基础上,通过统计不同胚胎发育阶段进行离心去脂的冷冻效果，优化Cryotop玻璃化冷冻体系，以期提高猪胚胎冷冻成功率,为猪胚胎的冷冻保存提供借鉴。

二、研究内容：1.研究猪孤雌激活胚胎使用Cryotop方式冷冻的的最佳发育阶段；2.研究离心去脂对不同发育阶段孤雌激活胚胎Cryotop冷冻复苏后存活率的影响；3研究离心去脂对不同发育阶段孤雌激活胚胎Cryotop冷冻复苏后第7天囊胚率的影响；三、拟解决的问题：1.相关文献的查阅、理解；2.口吸管的练习，孤雌激活等技术的掌握；3.现有Cryotop技术的掌握；4.冷冻复苏时各个步骤的严格执行；

3. 研究的方法与方案

一、研究方法：在查阅文献、借鉴前人经验和以往成果的基础上进行适当改进，并通过实验进行实施，通过控制变量法得到相关结果。

二、技术路线： 见附件三、实验方案：1.从猪卵巢上2mm-6mm卵泡中采集致密且至少2层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合物（COCs），体外成熟42-44h；2.挑选排出极体的卵进行孤雌激活（D0），孵育4h后培养箱中培养；3.挑选D4、D5、D6桑椹胚，以及D6天刚形成一点腔的囊胚，用Cryotop方式进行冷冻复苏；4.每日冷冻的胚胎培养24h后观察存活率，并且D7观察其囊胚率；5.通过得到的数据分析确定最佳冷冻阶段（Dx）；6.最佳冷冻阶段（Dx）确定后，分别选取D（x-1）、Dx、D（x 1）天胚胎重复上述步骤；四、可行性分析：实验室长期从事卵母细胞相关研究，猪卵来源稳定，卵母细胞采集、成熟、孤雌激活等技术成熟；相关实验仪器完备，实验条件优良。

4. 研究创新点

猪胚胎冷冻之所以如此困难，很大程度是由于其脂滴含量丰富，因此去脂理论上可以提高猪胚胎的冷冻效率，并且已经有实验证明了这一点。

然而，目前还没有对猪孤雌激活胚胎离心去脂后，进行 Cryotop冷冻的效果的讨论。

5. 研究计划与进展

2014年10月 至 2015年02月 相关技术的熟练、掌握，实验的准备；2015年02月 至 2015年05月 实验实施和数据采集；2015年05月 至 2015年06月 实验数据处理分析、毕业论文的撰写及答辩；