刀鲚乙二醛酶I基因的基因表达及克隆开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

刀鲚(coilia nasus)又名长颌鲚，俗称刀鱼。隶属于鲱形目(clupeiformes)鳀科(eagrauldae)鲚属(coilia)。在我国黄海、渤海、东海和通海的江河如辽河、海河、黄河、长江等均有分布［1］因其脂肪丰满、肉质鲜嫩, epa和dha含量丰富。 故有长江三鲜之首的美誉, 是长江中下游一种具有重要经济价值的洄游性鱼类 [2]。

由于每年清明前后不断攀升的市场需求导致其捕获季节一再提前[3]、捕捞强度不断提高, 在酷渔滥捕、生态环境恶化以及产卵场遭到破坏之下，刀鲚资源日益衰竭, 目前不仅其资源急剧衰退, 还引起了刀鲚肉质的变化[34]。据调查, 相比早年长江刀鲚, 目前刀鲚肉质鲜美程度明显下降, 体内残毒含量显著增加[5-6]，而且已不能形成渔汛。 因此, 开展刀鲚的人工养殖并进行繁殖技术攻关已迫在眉睫。

近年来将捕获的野生洄游型刀鲚幼鱼在试验基地进行驯化养殖以求获取商品鱼，并取得了成功[7]。徐跑等[8]发明了一种全人工的繁殖方法，突破了刀鲚人工繁殖的难题，使刀鲚人工繁殖的催产率达到33%，受精率达到48%，孵化率达到44%。郑金良等[9]发明了一种池塘生态养殖的方法，显著的提高了鱼苗的成活率。徐刚春等[10]发明了一种人工养殖刀鲚的方法，使刀鲚的成活率高达90%，可在2年内由5 g左右长到100 g以上，且养殖的刀鲚品质高。但是这并没有完全解决问题，部分刀鲚对环境适应性一般，常发生应激反应而导致死亡据。据了解刀鲚的gloi（glyoxalase i,乙二醛酶i基因)与应激反应有关， 着手于此是个扩增资源的方法之一。

2. 研究的基本内容和问题

目的：通过研究乙二醛酶i基因的基因序列，探索乙二醛酶i基因在刀鲚的应激反应里起了什么样的作用，从而改善刀鲚的应激情况，为大量人工培育提供科学依据。

内容：1、得到刀鲚乙二醛酶i基因的基因序列 2、克隆

拟解决的关键问题：设计引物、dna回收率

3. 研究的方法与方案

研究方法：以刀鲚为实验材料，提取其gloi的rna来进行一系列不同的实验操作。

技术路线：rna→cdna→已知序列验证→设计特异性引物→1stpcr反应→2ndpcr反应→3rdpcr反应→取各反应液进行电泳→dna测序→克隆

实验方案：提取rna→反转成cdna→扩增截取片段，验证已知序列→设计特异性引物→进行1st,2nd,3rd pcr反应→取上诉各步反应液各5ml，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳→切胶回收清晰电泳条带→进行dna测序→连接外系，建立t载体→转化入大肠杆菌→经过一晚的繁殖→挑选单独菌落→pcr反应→再次进行电泳→查看其扩增片段是否之前截取正确

4. 研究创新点

对于乙二醛酶I基因，目前还未有人进行关于刀鲚的方向。而刀鲚又属于珍贵鱼种，若想大量养殖则必须解决它的应激反应。对刀鲚乙二醛酶I基因的研究将会对应激现象进行进一步改观。

5. 研究计划与进展

1、2014.07-收集各种关于刀鲚的资料，关于非刀鲚物种乙二醛酶有关资料。参考其他人的实验，设计实验步骤。

2、2014.08-在导师及资料的帮助下，开始进行实验。仔细对待每个环节，若是得不到结果到或者得到异常的结果，反省从来。观察电泳图片并学会切胶。反复进行实验，熟悉每个步骤。

3、2014.12-与导师相互交流，大量查阅资料，开始进行论文撰写。