1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 1背景： 改革开放以来，我国的经济水平不断提高，我国养猪业持续发展，目前已成为世界最大的养猪国家[1]。由于外国猪种的生长速度相对较快而且瘦肉率高[2]，同时为了迎合消费者的需求和追求更大的经济效益，企业不断地引进外国猪种，例如大白猪、长白猪和杜洛克猪等。相对于中国地方猪种的母性相对较好，攻击行为相对较弱，外国猪种时常发生攻击行为，包军（2001）等做了关于异物特征和断尾处理对断奶仔猪啃咬行为及其生产性能的影响试验，结果发现断尾之后猪的咬尾行为下降，断尾可以有效避免断奶仔猪咬尾行为的发生，有利于提高日增重和饲料效率[3]，因此现在的许多高密度现代养殖场通过断尾和剪牙手术来预防咬尾行为的爆发[4]，然而随着动物福利的意识的提高和人们的认知的提高，对于断尾和剪牙的行为不断提出质疑，改善动物福利问题在经济学角度上来看也有利于经济的发展，由于动物福利意识的不断提高，欧美国家出台了相应的动物福利的政策和法律来维护动物的一些权益，此外世界贸易组织（WTO）也提出了一些动物福利的条款，然而我国作为世界上的畜产品进出口大国，同时也因为动物福利的问题销毁过很多畜产品，造成了很多的经济损失，因此随着动物福利的日益凸显，提高动物福利不仅有利于提高畜牧场的科学饲养管理水平，而且有利于经济的发展，因此对攻击行为的研究也迫在眉睫，由于中国地方猪种母性好，很少发生攻击行为，许多畜牧场很少进行断尾剪牙手术[5]，因为攻击行为有一定的遗传性，所以完全可以通过育种的手段培育出攻击行为较弱的猪种。苏淮仔猪断奶混群之后由于各种因素的差异，容易在群体间引起攻击行为。本实验主要研究苏淮仔猪在断奶混群之后发生的攻击行为，以及如何减轻混群后仔猪之间的攻击性行为。 5-HT对于攻击行为的研究具有举足轻重的作用，脑中五羟色胺（5-HT)水平与抑郁症、自尽和攻击行为等行为具有一定的相关性。法国Saudou等人发现缺乏5-HTIB受体鼠的侵犯行为比正常鼠更快、更强。研究发现，5-HT1B的存在影响着攻击行为的强弱，人们通过研究发现了5-HT转运体基因启动子的多态性，与5-HT低水平的基因表达、暴力自杀行为等有关。LiaoDL等研究人员已证实在中国男性中5-HTTLPR S-等位基因的男性大众比LL-等位基因者更容易于发生极度的攻击行为。5-HT基因在人类大脑边缘部与纹状体表达最高，而这些脑区的功能与人类的情感状态相关[6]，这些情感包括一些愤怒或与攻击行为相关的。 TPH是5-HT合成的关键酶和限速酶，其水平改变会导致5-HT的代谢紊乱。虽然TPH的分布因所在组织的不同而有很大差异，但是它和5-HT的含量在相应区域内的分布应该是统一的[7]。所以，TPH合成5-HT的这种专一性和独立性成为追踪5-HT比较可靠的标志物。在基因水平，TPH作为与人类精神疾病相关的候选基因被广泛认可。TPH基因编码了TPH的表达和合成，TPH-1基因位于染色体11P15.3-P16上，跨度29 kb，涵盖了11个外显子[8]，而TPH-2基因位于染色体12q15上，有11个外显子，共跨越95.3 kb[9]。虽然TPH-1基因和TPH-2基因在染色体上的位置和跨度不同，二者的氨基末端绝大多数也不相同，但是二者的表达产物在蛋白质水平上有70％的同源性，TPH-2要比TPH-1多了42个氨基酸，但是绝大部分TPH-1的特征都会在TPH-2中得到体现。在TPH-1的基因启动区有A-6562G、G-5806G、T-7180G和C-7065T 4种常见的变异。Tsai等[10]发现携带218A等位基因的人群抑郁症发作和自杀的危险系数更高。陈璐等[11]将大量单相思抑郁患者与健康患者对比发现：TPH-2基因上的rs11178997单核苷酸多态性与女性单相抑郁症有显著联系。焦阳等[12]研究发现：TPH-2基因位点上的rs11178997与G1463A的交互作用在单相抑郁症的发生中影响巨大。综上所述，TPH可以通过其生理活性和表达水平控制5-HT合成，进而影响仔猪的攻击性行为。 2.目的和意义： 为了探究猪色氨酸羟化酶基因多态性与混群后攻击行为强弱的关系，本实验在淮阴种猪场对断奶仔猪进行攻击性实验和通过观察混群后的录制视频选择出攻击行为强和弱的仔猪，采取相应仔猪的耳样保存，在查阅大量文献，选择色氨酸羟化酶作为可疑基因，利用应用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术，对色氨酸羟化酶基因进行的扩增并测序，对所得到基因序列进行SNP位点的筛选，并利用SPSS中的卡方检验对SNP位点的攻击行为强弱的猪的不同基因型进行相关性分析。最终通过研究色氨酸羟化酶基因的多态性，有效控制仔猪混群后的攻击行为，从而提高动物福利，提高生产。 |
| 参考文献： [1]孙德林，贾海燕.2014年中国猪肉进口量与世界主要猪肉交易市场概况.猪业科学，2015，02:46-47. [2]杨公社.猪生产学.北京：中国农业出版社，2002:24-48. [3]异物特征和断尾处理对断奶仔猪啃咬行为及其生产性能的影响，崔卫国； 包军，家畜生态，期刊，2001-05-28 [4]TaylorNR，MainDC，MendlM，EdwardsSA.Tail-biting:anewperspective.VetJ，2010，186:137-147. [5] 孟宪武. 猪福利养殖引发的思考. 猪业科学， 2015， 9:122-123. [6]Demchyshynl,Sunahara RK，Miller K，etal.Ahuman serotonin1D receptor variant(5HT1D-beta) encoded by anintronless gene on chromosome6.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，1992，89:5522-552 [7] 万选才，杨天祝，徐承煮. 现代神经生物学[ M ] . 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：130-158 [8] Ledley FD，Grenett HE，BartosDP，et al. Assignment of human tryptoan hydrolase locus tochromosome 11：gene duplication and translocation in evolution of aromatic amineacid hydroxylases[ J ] .Somatic Cell and Molecular Genetics，1987，13 ( 5 )：575-580. [9] Zill P，Baghai TC，ZwanzgerP，et al. SNP and haploty analysis of a noveltrytophan hydroxylase isoform（TPH2）gene provide evidence for association with major depression.[ J ]. MolPsychiatry，2004，9 ( 11 )：1030-1036. [10] Tsai SJ，Hong CJ，Wang YC. Tryptophan hydroxylase gene polymorphisn（A218C）and suicidal behaviors[ J ] .Neuroreport，1999，10 ( 18 )：3773-3375. [11] 陈璐，马靖松，杨艳杰，等. TPH2rs11178997基因多态性与女性抑郁及自杀行为的关联性分析[ J ] . 中国妇幼保健，2013，17 ( 28 )：2686-2689. [12] 焦阳，马靖松，邱晓惠，等. TPH2基因交互作用与单相抑郁症关系[ J ] . 中国公共卫生，2014，30 ( 6 )：712-714.
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2. 研究的基本内容和问题
3.研究目标
本实验尝试应用聚合酶链反应(pcr)技术对色氨酸羟化酶在苏淮仔猪中的突变环境下，阐发色氨酸羟化酶受体基因的基因型与猪攻击行为之间的接洽以期找到一种可以展望攻击性行为在分子生物学检测上的遗传根据。
3. 研究的方法与方案
| 6 实验方案 6.1实验分组 通过观察80头60日龄左右的苏淮猪混群后的视频，记录攻击行为，分析出攻击行为强和攻击性行为弱的猪，并分为2组。 6.2预测色氨酸羟化酶的核心启动子区 下载色氨酸羟化酶基因的转录起始点上游 -2000 bp 至转录起始点的下游 500 bp的序列，通过三个预测网站分别进行色氨酸羟化酶基因核心启动子区的预测。 ①基因序列的获取: 在核酸序列数据库NCBI查询的基因序列 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/e!Ensembl Ensemble：http://asia.ensembl.org/index.html ②核心启动子区预测： NeuralNetwork PromoterPrediction http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html Promoter 2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/ Promoter SCAN https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/ ③转录因子结合位点预测： The JASPAR database http://jaspar.binf.ku.dk/cgibin/jaspar_db.pl?rm=browsedb=coretax_group=vertebrates ④CPG岛预测： MethPrimer http://www.urogene.org/methprimer/ 6.3引物设计 引物设计通过引物设计网站NCBI进行，将通过软件设计得到的多对引物输入到美国国立图书馆数据库的BLAST中进行引物的同源性比较(网址:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)（如表1），选出同源性最小而Tm值合适的引物确定为PCR反应引物。
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| 6.4总DNA的提取 常规酚-氯仿法抽提研究对象耳组织样品DNA，通过一些步骤提取： ①剪取100mg左右耳组织样放入2mlEP管中，充分剪碎之后加1ml裂解液和30ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀之后放到55之的金属浴消化、过夜。直到管中没有组织块。 ②在EP管内加入800ulTris平衡酚，在摇匀器上混匀10min，然后在离心机上，4然，12000rpm离心15min。 ③吸取650ul上清液于新的2mlEP管内，加入Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）1000ul。在摇匀器上混匀15min之后放入离心机4后，12000rpm离心12min。 ④吸取550ul上清液到2mlEP管内，加入800ul的氯仿，在摇匀器上混匀10min之后放入离心机4后，12000rpm离心12min。 ⑤离心后吸取450ul上清液到1.5EP管中，加入预冷的无水乙醇和40ul的乙酸钠溶液，摇晃后放入离心机4乙，12000rpm离心5min。 ⑥弃上层液体，加入400ul的70%的乙醇，反复吹打放入离心机4乙，12000rpm离心5min。 ⑦弃上层液体，放置超净台到EP管无水滴，烦躁时间约为30min。 ⑧加入50ul去离子水，是的DNA完全溶解，最后放置到-20解的冰箱没保存。 6.5聚合酶链反应(PCR)条件及产物分析 建立一个20ul的反应体系，其中组分含量为：LA Taq Master Mix为10ul，P1-F为0.5ul，P2-R为0.5ul，ddH20为8ul。DNA模板为1ul。 PCR扩增的反应程序为；998℃预变性30 s；循环扩增阶段:98℃变性30s→（Tm）退火30 s→72℃延伸45 s，循环35次；最后在72℃保温7分钟终末延伸。 扩增反应结束后，PCR产物提取6 ul用凝胶电泳进行检测，电泳条件为电压130 v，时间为20 min，在凝胶成像系统中观察条带，条带明亮，位置正确后将部分PCR产物送到生物公司测序。 6.6筛选SNP位点 PCR产物测序结果由擎科生物公司返回，使用DNAMAN8和Chromas进行SNP位点的筛选，鉴定个体的基因型。 6.7数据处理 使用统计产品与服务解决方案（StatisticalProduct and Service Solutions，SPSS）进行数据统计。利用卡方检验计算TPH与猪攻击行为之间的相关性分析，显著性使用P＜0.05标注。
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4. 研究创新点
特色或创新之处
在已有研究的基础上，根据原理的分析和大胆的设想，通过探究色氨酸羟化酶基因的多态性与猪攻击行为之间的相关性，找到一种可以展望攻击性行为在分子生物学检测上的遗传根据。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2019年03月 查阅相关文献资料，申请课题。
2019年04月 进行聚合酶链反应(pcr)及产物分析
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