HDAC3在猪卵母细胞体外成熟中的作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、 本课题的意义

卵母细胞发育是雌性生殖过程的重要环节之一。在人类，卵母细胞质量低下会导致女性不孕不育、自发流产及出生缺陷等重大生殖疾病。在农业领域，卵母细胞的质量也与多精受精及胚胎发育潜能等直接相关，决定了动物繁殖率的高低及由此而产生的畜牧业经济效益。因此，深入研究卵母细胞发育调控的分子机制，对于改善人类生殖健康状况以及提高家畜繁殖力均有重要意义，为当前我国经济和社会发展战略的迫切需求。本课题旨在通过一些细胞生物学方法来初步鉴定hdac3在猪卵母细胞成熟中的作用，为探索改善卵子质量、预防生殖疾病和出生缺陷的提供可能途径。

2. 研究的基本内容和问题

一、 研究的目标

1、用hdac3特异sirna(smallinterfering rna)抑制其hdac3水平，观察抑制hdac3后猪卵母细胞减数分裂进程的变化。

2、利用免疫荧光染色等技术观察实验组卵母细胞减数分裂成熟进程的影响，及对减数分裂成熟装置（如染色体、纺锤体等）的影响，进而探讨hdac3在猪卵母细胞成熟中的作用。

3. 研究的方法与方案

一、 研究方法

1、取6-8周发育完全的猪GV期卵母细胞，在培养液中培养0h（GV期）、3h（GVBD）、7h（MI）、9h（AI-TI）、14h（MII），观察HDAC3在猪卵母细胞发育过程中的定位。

2、取6-8周发育完全的猪GV期卵母细胞，体外敲低HDAC3蛋白，在培养液中培养3h,统计GVBD率，培养14h，统计第一极体排出率，观察卵母细胞成熟状况。

3 、取6-8周发育完全的猪GV期卵母细胞，体外敲低HDAC3蛋白，在培养液中培养14h,通过免疫荧光染色观察纺锤体染色体是否异常。

4 、取6-8周发育完全的猪GV期卵母细胞，体外敲低HDAC3蛋白，在培养液中培养7h,通过免疫荧光染色观察动粒微管连接是否异常。

二、 技术路线

1、卵母细胞收集和培养：

在注射5IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）后46-48小时，从6至8周龄的雌性ICR猪的卵巢中收集完全生长的积云卵母细胞。 为了获得裸露的卵母细胞，通过反复吹打移除卵丘细胞。 为了体外成熟，卵母细胞在矿物油下于37℃下在5％CO2培养箱中在M16培养基中培养。

用Narishige显微注射器将siRNA微量注射于猪卵母细胞中，将siRNA，用于敲低分析，再将等量的阴性shRNA注入卵母细胞中作对照。注射后，将卵母细胞在含有2.5μM米力农的培养基中在GV阶段停滞20小时，然后在不含米力农的培养基中培养以使其成熟。

3、免疫荧光：

将卵母细胞在4％多聚甲醛中固定30分钟并用0.5％Triton X-100透膜20分钟。 三次洗涤后，将卵母细胞在室温下在1％BSA的PBS中封闭1小时。 将样品与第一抗体在4℃温育过夜，然后在室温下用第二抗体孵育1小时。 为了检查动粒，用CREST抗体共同标记卵母细胞。 用Hoechst 33342（蓝色，1：300）或碘化丙啶（红色，1：200）将染色体复染10分钟。将卵母细胞样品安装在防褪色培养基（Vectashield）上并在配备有40X或63X油目标的LSM710激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss）下检查。 ImageJ软件（美国国立卫生研究院）用来量化荧光强度。

四、 可行性分析

1、项目指导老师顾玲老师多年来从事有关卵母细胞发育调控的分子机制的研究工作，经验丰富。

2、实验方案可行。完善的猪饲养条件、成熟的猪卵母细胞采集和培养体系是本项目进行的前提，免疫荧光染色等技术的应用是项目方案可行的保证。

3、了解试验过程中所用的试剂的配置以及仪器的使用方法，基本掌握了试验流程；掌握了猪卵母细胞的采集以及体外培养，免疫荧光染色及蛋白免疫印记等操作技术；查阅了相关文献，理论知识准备充分。

4. 研究创新点

HDAC3是一种普遍存在的蛋白，但是人们对于其在卵母细胞成熟过程中的作用却一无所知。本课题从组蛋白乙酰化修饰方面，首次通过HDAC3在猪卵母细胞减数分裂过程中的作用，探讨卵母细胞的减数分裂调控机制。

5. 研究计划与进展

2018年9月至2018年12月：熟练掌握猪卵母细胞的采集以及体外成熟培养，免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜的使用等操作技术。

2019年3月至2019年5月：完成全部主体实验。

2019年4月至2019年5月：本科生毕业论文撰写，并准备答辩等相关事宜。