1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一直以来，人们对于鸡的需求量很大。随着人们物质生活水平的提高，需求量也是日益增大，鸡蛋市场更是如此。因此如何提高家禽鸡的产蛋率以适应不断上升的鸡蛋需求量成为人们关注的焦点，人们开始进行了这方面的探索。众所周知，鸡的产蛋性能主要取决于卵巢和卵泡的发育情况。对卵巢的研究，有助于从源头上增加产蛋母鸡产蛋数量，从而增进市场的经济效益。
双酚a(bisphenol a,bpa)被认为是环境内分泌干扰物最具有代表性类雌激素物质，它之所以具有类雌激素的作用，是因为它的分子结构和雌激素的分子结构类似。据研究表明，bbpa不仅可以与体内或体外与雌激素受体α（erα）、β（erβ）和γ（erγ）结合，而且还可以干扰内源性雌激素合成[1]，并与内源性的雌激素竞争继而发挥雌激素的作用。在鸡胚性腺中，两性的性腺均表达raldh2。在e12.5开始，左侧性腺中cyp26b1逐渐从全卵巢表达向只在髓质表达的方向发展，即卵巢皮质内ra浓度升高，生殖细胞开始表达stra8, 进入减数分裂阶段。右侧雌性性腺及雄性性腺中，raldh2 和cyp26bl同时持续表达，导致新产生的ra被降解，没有生殖细胞减数分裂起始出现。因此，ra对生殖细胞减数分裂的进行非常重要[2]尽管bpa与er 的结合能力很微弱，但低剂量的bpa依然可以通过干扰体内雌激素的合成来加强其对雌激素的拮抗作用[3]。此外，bpa还可以抑制雌激素的活性，或干扰雌激素结合受体的活性[4]。有证据表明，低剂量暴露于bpa，特别是在生命周期的敏感阶段暴露，可能引起激素分泌、发育或生殖能力的改变，导致雄性和雌性生殖系统的损害。研究发现高剂量的bpa 使机体内下丘脑-垂体-性腺轴的建立异常、雌性后代提早性成熟、雌性生殖器官发育和胎儿卵母细胞减数分裂异常［5］，进而影响雌性动物正常的生育能力。低剂量bpa的长期暴露也会对雌性动物的生育能力产生长期不良的影响［6］。因此，bpa 作为日常生活中普遍接触的物质，其不良影响目前已引起了人们的高度重视。但以往的研究主要集中在对雄性生殖毒性和妊娠期暴露的发育毒性，而对雌性生殖毒性研究较少。仅有少数研究提示bpa 可能影响有腔卵泡发育和性激素生成，对其作用环节和机制尚不清楚。
本研究针对双酚a对胚胎期卵巢发育的影响来进行试验。对于不同发育阶段的雌性哺乳动物接触到不同浓度的bpa，将会对卵巢组织的发育产生不同程度的影响，其会影响卵泡和卵母细胞的发育进程，干扰颗粒细胞的正常功能，进而影响雌性动物的生育能力[7]。bpa可影响卵母细胞的整个发育阶段，造成卵母细胞第一次减数分裂前期染色体分离异常，染色体片段相互交换和错配的比率明显增高，降低了卵母细胞在减数分裂阻滞期的存活率，抑制了卵母细胞减数分裂的恢复。zhang等［8］对怀孕12.5d的孕鼠进行0.02～0.08mg/(kg·d)的bpa处理，随着bpa 浓度的升高，出生后3d仔鼠卵巢中原始卵泡的数量显著降低，在仔鼠生殖脊部位出现了更多裸露的、未被包裹的卵母细胞。这些卵母细胞由于减数分裂相关基因stra8、dmc1、Ｒec8和scp3的表达下降，阻止了其进入第1次减数分裂的前期，导致原始卵泡的形成失败。hunt 等［9］对 4 月龄的恒河猴胚胎进行 bpa 处理，发现bpa 影响了卵母细胞在第1次减数分裂前期染色体的分离，扰乱了卵母细胞第1次减数分裂的进程。同时，bpa也可以通过与膜eＲ的结合，扰乱卵母细胞正常的生理代谢活动。brie o-enríquez 等［10］也发现1μmol/lbpa可显著降低卵母细胞的存活率，使卵母细胞的退化率提高了5倍。卵母细胞正常生理功能活动的紊乱，导致了卵母细胞的闭锁退化。bpa对于哺乳动物卵巢的影响是十分重要的，但对禽类的研究较少。根据之前实验表明， bpa能够促进鸡胚卵母细胞减数分裂。bpa能在体内和体外分别促进卵母细胞减数分裂标志基因（stra8，scp3，dmc1）的表达。体内注射bpa可使鸡胚卵巢皮质厚度增厚，显著提高减数分裂标志蛋白γh2ax的表达。bpa通过雌激素受体erβ调节卵母细胞减数分裂。可以显著提高erβ基因的表达，进而促进减数分裂相关基因的表达，诱导减数分裂过程[11]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过注射双酚a和pbs进行对照试验，观察不同胚胎期鸡卵巢发育的情况，包括对于减数分裂的影响。来说明双酚a作为一种类雌激素对雌鸡发育的作用，进而有助于从源头上增加产蛋母鸡产蛋数量，增进市场的经济效益。
研究内容:本研究主要通过对照试验来进行。从10.5天开始，实验组注射0.05ug/ml双酚a，对照组注射pbs，共注射四次。并采集15.5天，18.5天，20.5天的卵巢组织。采集的卵巢一部分染色制作切片，观察卵巢形态和内部结构的变化；另一部分的卵巢提取dna和rna，在通过半定量、蛋白质dot等实验探索与减数分裂相关基因表达的变化，最后得出双酚a 对于胚胎期卵巢发育的影响。
3. 研究的方法与方案
研究方法
试验设计：单因素实验设计，0.05ug/ml双酚a以及pbs作对照，从10.5天开始隔一天注射。采集15.5天，18.5天，20.5天三个时期的卵巢组织。每个处理三个重复。
试验方法与样品采集：
4. 研究创新点
通过计数卵巢减数分裂时各个减数分裂细胞数目，与正常孵化的鸡胚作对比，并做了重复处理，使得实验数据更加真实合理。整个实验从发育的源头开始，一直追溯到相关基因的变化，让双酚A的作用机制更加深入，更加完整。并且对之后关于类雌激素的实验研究能够提供充实的理论基础。
5. 研究计划与进展
2018.1-2018.11查阅文献资料、实验设计
2019.2-2019.3 注射实验，采集卵巢组织，处理样品
2019.3-2019.4提取dna或rna，蛋白质dot实验，半定量检测
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