和缓艾美尔球虫肌动蛋白解聚因子（ADF）基因的克隆和表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

鸡球虫病是严重危害养禽业的重要寄生虫病,全世界每年因鸡球虫病造成的经济损失约为20 亿英镑[1]。

该病主要由艾美尔属的7种球虫引起，包括柔嫩艾美尔球虫（e.tenella）、毒害艾美尔球虫(e.necatrix)、堆型艾美耳球虫(e.acervulina)、巨型艾美尔球虫(e.maxima)、早熟艾美耳球虫(e.praecox)、布什艾美尔球虫(e.branetti)及和缓艾美耳球虫(e.mitis)。

在上述几种球虫中，以柔嫩艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫危害较为严重，鸡只感染后大肠上皮细胞受损而导致出血，产生血便，体重下降，饲料比升高，严重者造成鸡只大量死亡[2,3]。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究的目标：克隆和缓艾美尔球虫肌动蛋白解聚因子基因并获得其重组蛋白。

2、研究内容：（1）基因克隆：设计肌动蛋白解聚因子（adf）基因特异性引物，提取和缓艾美尔球虫虫体总rna，用rt-pcr技术扩增肌动蛋白解聚因子（adf）.（2）原核表达载体的构建：将adf质粒克隆入原核表达载体pet32a，构建pet32a-adf重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌bl21，用pcr和双酶切试验进行鉴定。

（3）重组蛋白的表达与鉴定：转化后的重组质粒用iptg进行少量诱导表达，然后用sds-page电泳检测重组蛋白的表达情况。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法：培养收集和缓艾美耳球虫卵囊，孢子化后提取虫体总rna，通过逆转录获得cdna，以该cdna为模板，用pcr扩增dna序列 ，再与原核表达载体pet32a连接，构建成重组载体，转化大肠杆菌bl21，iptg 诱导重组融合蛋白表达，sds-page电泳检测重组蛋白的表达情况。

然后大量表达并纯化蛋白。

2、技术路线：人工和缓艾美耳球虫感染实验鸡，培养虫体收集鸡的粪便收集球虫卵囊卵囊孢子化提取总rna逆转录得到cdnapcr扩增基因与pet32a构建载体，转入感受态细胞bl21并诱导表达得到该重组蛋白检测重组蛋白的表达情况大量表达重组蛋白纯化蛋白3、实验方案：（1）和缓艾美球虫纯种孢子化卵囊(1.0 105 /只)接种50只雏鸡, 第5-7d收集鸡的粪便，然后收集纯化球虫卵囊, 将纯化的卵囊孢子化，用trizol法收集和缓艾美球虫总rna，逆转录技术获得cdna。

4. 研究创新点

(1) 国内很少有人研究和缓艾美耳球虫，目前e.mitis感染的防治只是囊括在防治各种危害严重的球虫感染方案之内，并没有比较针对性的治疗方法，所以本实验的研究将对于和缓艾美耳球虫重组疫苗的研究提供候选基因。

(2) 从肌动蛋白解聚因子（adf）方面研究e.mitis治疗手段的报道较少见。

目前在柔嫩艾美尔球虫等致病性较强的球虫开展的研究较多，针对e.mitis肌动蛋白解聚因子（adf）的研究报道较少。

5. 研究计划与进展

2015-09：熟悉和缓艾美耳球虫虫体，人工感染雏鸡，收集粪便和球虫卵囊。

2015-10：提取mrna，逆转录为cdna，pcr扩增adf基因。

2015-11：与原核表达载体pet32a连接,构建成重组载体，转化感受态细胞bl21，pcr和双酶切试验进行鉴定。