构建表达犬瘟热病毒H和N蛋白的重组马疱疹病毒1型BAC开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

犬瘟热（caninedistemper，cd)是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)引发的急性、高度接触性传染病[1]。该病呈世界性分布，在物种间能够引起交叉感染，感染宿主包括犬科、鼬科及浣熊科等科的多种动物，且宿主范围还在不断扩大。在不同动物中表现为不同的致死率［2,3］。cd的传染源为患病或带毒动物。cdv主要是通过呼吸道，其次是通过消化道进行传播。主要临床特征是双相热,白细胞减少,结膜炎,支气管炎,卡他性肺炎,胃肠炎,皮炎及神经症状,部分病例脚垫高度角质化,后期出现明显的神经症状[4]。该病发病一般无季节性，但在春、冬季节发病更加频繁。由于近年来养犬业的迅速发展以及犬的频繁交流调运，导致群体的免疫水平参差不齐，发病周期呈现不规律性。

马疱疹病毒(equineherpesvirus,ehv)属于疱疹病毒目,疱疹病毒科，是引起马呼吸道疾病,妊娠母马流产和神经系统疾病的主要病原。这一病毒基因背景清楚，基因组中含有多个复制非必需基因，插入外源基因的重组病毒可稳定表达外源基因，是构建病毒活载体疫苗的理想载体之一。马疱疹病毒rach株是已商品化的的疫苗毒株，其作为活载体疫苗已经报道表达马脑炎病毒、犬流感病毒、牛蓝舌病病毒、西尼罗病毒、猪流感病毒等多种动物病毒的保护性抗原。细菌人工染色体(bac)技术使ehv-1rach的基因组转变为bac，能在大肠杆菌中低拷贝复制，同时构建的bac质粒可在大肠杆菌中安全、快速且高效地进行基因删除、突变及插入，转染细胞后能够获得病毒。

过去，我国预防cd的措施多以接种灭活苗和弱毒疫苗为主。但是，前者产生的抗体下降较快,抗原性差,且仅能诱导体液免疫,免疫时间短，而后者的广泛应用在控制cd发生的同时，也为弱毒株在种群间传播提供了便利条件，导致感染宿主的增多和变异株的出现，进而使cd的防控形式愈发紧张。因此，研制以某种非致病性病毒或细菌为载体，采用dna重组技术构建表达cdv保护性抗原的重组疫苗势在必行。重组活载体疫苗能够在免疫动物体内随载体的复制而表达，完全保留了外源蛋白的抗原活性，同弱毒疫苗株一样可启动体内多种形式的免疫应答，是理想的疫苗形式。当前，国外学者研究cdv重组活载体疫苗时使用较多的载体是痘病毒[5-8]，国内主要以腺病毒为主[9]。

2. 研究的基本内容和问题

目标：构建以马疱疹病毒rach株为载体,能分别表达犬瘟热病毒h和n蛋白的重组病毒h-ehv和n-ehv，为研制安全有效、低成本的新型cd活病毒载体疫苗来防控cd奠定基础。

内容：

1、rach53株的复苏、扩增、鉴定、感受态的制备

3. 研究的方法与方案

一、研究方法：

本实验主要使用的研究方法是Red两步法同源重组技术、脂质体转染法。

二、技术路线和实验方案：

1、构建RacH-H、RacH-N转移载体

2、拯救重组病毒

三、可行性分析：

实验中所用RacH53株和RK13细胞在我们实验室有保存。而中间载体puc19-H、puc19-N已由南京钟鼎生物技术有限公司人员成功构建，为此次实验的进行奠定了良好的基础。

4. 研究创新点

在防治犬瘟热中，我国多以接种灭活苗和弱毒疫苗为主。但是，前者只能诱发体液免疫应答，而后者的广泛应用也为弱毒株在种群间传播提供了便利条件，导致感染宿主的增多和变异株的出现，进而使CD的防控形式愈发紧张。因此，研制以某种非致病性病毒为载体，采用DNA重组技术构建表达CDV保护性抗原的重组疫苗势在必行。当前，国外学者研究CDV重组活载体疫苗时使用较多的载体是痘病毒，国内主要以腺病毒为主。还未有报道用马疱疹病毒为载体构建的的活疫苗，若能研制成功，将大大提高防治犬瘟热的可能性。

5. 研究计划与进展

2015.3.1---2015.3.10：rach-53株复苏，扩增，pcr鉴定,提质粒；

2015.3.11---2015.3.25：puc19-h、puc19-n的复苏，扩增，提质粒，酶切，电泳回收片段；

2015.3.26---2015.4.20：复苏rk13（兔肾）细胞、rach-h、rach-nbac的构建