猪Mx2蛋白抑制日本乙型脑炎病毒增殖的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis b）又称日本乙型脑炎，简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。该病毒属于黄病毒科（flaviviridae）黄病毒属（flavivirus）的，单股rna病毒 ^[1,2]，jev编码3个结构蛋白、7个非结构蛋白。猪群最易感染，可导致怀孕母猪高热、流产、死胎以及木乃伊胎，公猪出现睾丸炎导致繁殖障碍，给养猪业造成严重的经济损失。同时每年全球有将近一万人死于此病。因此日本乙型脑炎已成为严重的公共卫生安全问题，世界卫生组织已加强对本病的检测和控制。到目前为止预防jev主要依靠疫苗接种，还没有针对jev的特异性治疗药物，所以寻找治疗jev的药物和方法是非常重要的^[3]。

jev于1870年在日本首先发现^[4]，并于1935年从患有乙型脑炎死亡病人、死马的脑组织和蚊虫中分离到该病毒，首次确定了乙型脑炎的病原^[5]。20世纪40年代经血清学鉴定和病毒分离证实乙脑在中国流行，并从北京市乙脑病例中分离到jev，随后陆续从各地分离到数百株jev。近年来乙脑流行区覆盖至包括亚洲和太平洋地区的24 个国家，约占世界60% 的人口生活在jev 的流行区。目前我国为乙脑高发区，平均发病数约占全世界乙脑发病数的80%以上^[6]。

jev是黄病毒科（flaviviridae）黄病毒属（flavivirus）的一员，其基因组为单股正链rna，全长约11kb，基因组由5'端非编码区，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框（orf）和3'端非编码区构成，无亚基因组结构。orf大小约10.3kb，编码一个多聚蛋白前体，经宿主、病毒蛋白酶切割加工，产生3个结构蛋白：核心蛋白（c）、膜蛋白（prm/m）、囊膜糖蛋白（e）、7个非结构蛋白（ns1，ns2a，ns2b，ns3，ns4a，ns4b，ns5）和两个多肽切割片段（pr和anch片段）^[7]。其基因组顺序从5′末端到3′末端的编码顺序为5-c-prm-e-ns1-(ns2a，b）-ns3-(ns4a，b）-ns5-3′ ^[8]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标：证明猪mx2蛋白有抑制日本乙型脑炎增殖的的作用，并且是通过作用乙脑病毒复制过程中的rna 多聚酶，ns5非结构蛋白来抑制其增殖的。

2.研究的内容

1.1通过间接免疫荧光实验（ifa）、免疫印迹实验（wb）鉴定猪mx2基因已经成功连接上pegfp载体，并且可以在bhk-21细胞上成功表达。测定gtp酶活性来鉴定mx2蛋白活性。

3. 研究的方法与方案

1.间接免疫荧光、免疫印迹实验证明pEGFP-Mx2的表达

2.定GTP酶活证明Mx2的活性

3.光定量PCR、空斑减少实验证明Mx2抗乙脑活性

4.荧光定量PCR证明Mx2抗乙脑的浓度依赖性

5.运用激光共聚焦、免疫共沉淀技术鉴别Mx2与NS5是否互作

4. 研究创新点

目前抗乙型脑炎的疫苗还不能做到百分之百的保护，所以要运用到抗病毒蛋白，干扰素本身就是一种抗病毒的蛋白质，Mx2是干扰素刺激机体产生的，目前还没有试验证明Mx2具有抗日本乙型脑炎病毒的文章，因此对猪Mx2抑制日本乙型脑炎病毒增殖进行初步研究。

5. 研究计划与进展

1.3月2号3月20号

通过间接免疫荧光实验（ifa）、免疫印迹实验（wb）、测定gtp酶活性实验鉴定猪mx2基因已经成功连接上pegfp载体，并表达出有gtp酶活性的mx2蛋白。

2. 3月21号4月10号