应用实时荧光RT-PCR技术检测PEDV开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

由猪流行性腹泻病毒（pedv）引起的猪流行性腹泻是一种通过粪-口传播的高度接触性肠道传染病，各年龄猪均易感。发病猪以呕吐、水样腹泻和食欲下降为特征。该病死亡率虽较猪传染性胃肠炎（tge）低，但因腹泻会影响猪只增重，且有试验显示断奶后的猪在猪场ped爆发后的7-10天内不会增重，这将导致育肥猪上市时间延迟1-2周，使养猪业生产蒙受重大损失。此外，在不再腹泻的情况下，感染猪的粪便中仍旧带毒，同时有证据表明在离感染猪群较远区域空气中的pedv也具有感染性，猪场在进行管理和大范围种群移动时应重视该方面[1]。因而通过检测pedv的存在来确诊该病以防范病毒的跨区域传播尤为重要。由于该病的临诊症状和病理变化都与tge十分相似，实际操作中多采用实验室检测方法进行病毒检测[2]。本课题研究内容即通过实验室检测方法如elisa、rt-pcr等对送检病料进行检测以确诊其是否感染pedv，从而达到阻止病毒传播、减少经济损失的目的。

研究表明，pedv在细胞培养中难以分离。爱荷华州立大学病毒分离实验结果显示在添加胰酶的vero细胞中分离到病毒的成功几率在5-10%。因而目前最广泛应用于检测pedv的方法即基于抗原抗体特异性反应的elisa检测以及基于核酸的pcr检测方法[3]。elisa法最大的优点即可从粪便中直接检查pedv抗原，应用较为广泛。在国外，由rodakl等利用pedvm蛋白的单克隆抗体建立的竞争阻断elisa诊断方法具有敏感性强、特异性高的优势，适用于pedv流行病学调查；kimo等建立的基于单抗的免疫组化法能在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确特异的检测出pedv，可用于鉴别诊断pedv和tgev[4]。目前，已有pedv和tgev的多重pcr检测方法，能够通过将多对引物混合进行单个扩增以确诊单一感染或混合感染，达到诊断和鉴别的双重目的，较传统检测方法更快速、方便[5]。

目前通过实验室检测技术对送检病料进行诊断已广泛应用于引进种猪及猪群转移等实际情况中。实验室检测技术的强敏感性、高特异性有利于快速准确地诊断该病，从而能有效防范病毒扩散和损失扩大。

2. 研究的基本内容和问题

1.1研究的目标

通过对送检样品进行实验室检测如elisa和rt-pcr等，能快速准确地确诊是否感染pedv。对同一批次样本可改变实验条件，从而优选出最佳检测方案。比较实时荧光定量rt-pcr与传统rt-pcr检测同一批次样本时的阳性率。

1.2研究内容

3. 研究的方法与方案

2.1研究方法

2.1.1依据送检单上的要求对相应病料进行elisa检测；

2.1.2依据送检单上的要求如是否进行混样对相应病料进行rt-pcr检测。

4. 研究创新点

间接ELISA是实验室检测猪是否感染PEDV的常见方法，该方法灵敏度高、特异性广、重复性强。通过使用PEDV的ELISA检测试剂盒使样品发生显色反应，颜色的深浅与样品中的猪流行性腹泻病毒抗体呈正相关。运用先进的光谱扫描多功能读数仪可以迅速准确的读出样品吸光度，再结合使用EXCEL可以计算出样品浓度，在一天内完成整个检测过程，得到检测结果。

RT-PCR方法具有优良的特异性、敏感度及准确性，其能快速简便精确地检测大量样品，并能通过软件进行核酸的定量分析。实时荧光定量RT-PCR与传统PCR技术比较可以省去繁琐费时的跑胶步骤，并且阳性的检出率更高。

5. 研究计划与进展

2015年3月2日至3月10日

查阅文献资料，了解感染pedv猪的病原学、流行病学、临床症状及诊断学特征，结合国内外先进实验室检测pedv技术设计实验初步方案，通过了解养殖场因该病的发生所蒙受的损失，明确课题的意义。

2015年3月11日至3月30日