犬流感病毒LAMP快速检测方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

2000年日本学者notomi在nucleic acids res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，英文名称为loop-mediated isothermal amplification， 缩写为lamp，中文名为蓝普。

短短几年，受到了世卫组织who、各国学者和相关政府部门的关注，该技术已成功地应用于sars、禽流感、hiv等疾病的检测中，在2009年甲型h1n1流感事件中，日本荣研化学株式会社接受who的邀请完成了h1n1蓝普法检测试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病症的快速蔓延起到积极作用。

目前，通过荣研公司近十年的推广，lamp技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。

2. 研究的基本内容和问题

本次课题的研究目标为利用蓝普技术研制快速检测试犬流感病毒剂盒，其中最为关键的问题是扩增引物的设计，lamp引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。

在进行lamep引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：1.引物之间的距离　f2区段的5端到b2区段的5端(lamp反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。

f3区段的3端到f2区段的5端之间的距离是0~20bp(同理b2和b3之间的距离是0~20bp)。

3. 研究的方法与方案

本次试验总的流程分为三步：一、病毒培养；二、lamp扩增；三、扩增产物鉴定。

首先利用mdck犬肾传代细胞培养犬流感h3n2病毒，并对产物进行鉴定。

然后灭活病毒，提取rna，利用反转录酶进行反转录得到cdna，接着利用引物与酶进行lamp扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

4. 研究创新点

lamp技术的优势除了高特异性：、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像pcr那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。

在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。

5. 研究计划与进展

3月2日3月13日课题拟定与资料收集3月16日3月28日 完成开题报告3月30日----4月30日 完成试验5月1日---5月20日 分析试验结果，完成毕业论文