鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义随着经济社会的发展，养殖业越来越成为增加农民收入的一种重要产业。而鸭坦布苏病毒病是2010年春季我国新出现的一种导致鸭、鹅产蛋量急剧下降的传染病。其在我国华东地区首次发生，现在已经传播到我国大部分水禽养殖地区。该病的主要临床症状表现为发热，食欲下降，运动障碍，产蛋量急剧下降，后期表现为神经症状，共济失调，甚至瘫痪。其病理变化表现为卵泡出血、变性和破裂。该病发病率可高达100%，病死率在5%~30%之间[1]。目前已证实，引起该病的病原为鸭坦布苏病毒。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)属于黄病毒科、黄病毒属，病毒大小为50nm左右，是不分节段的单股正链RNA病毒。DTMUV基因组包含一个长的开放读码框，编码约含3400个氨基酸残基的聚蛋白分子。聚蛋白经蛋白酶剪切加工得到衣壳(capsid，C)蛋白、prM蛋白和包膜E蛋白三种结构蛋白以及7种非结构蛋白。其中C蛋白是病毒颗粒的构成成分之一，以多拷贝的形式与单拷贝的病毒基因组RNA共同构成病毒的核衣壳结构[2]。因此，研究鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的表达，对于了解坦布苏病毒的C蛋白的功能有重要价值，可以为抗体的制备及疫苗的研究提供理论依据，从而更好地预防鸭坦布苏病毒病，发展我国的禽类养殖业。综上所述，研究鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达具有重要的理论意义和现实意义。2.国内外研究概况一方面目前对鸭坦布苏病毒的研究非常多。董嘉文等对鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达及其免疫原性进行了研究[1]。柴顺秀等成功表达并鉴定了鸭坦布苏病毒E蛋白主要抗原区域[3]。潘异哲等利用原核表达系统表达了禽坦布苏病毒NS1蛋白[4]。这些研究主要是从E蛋白及NS1基因等方面研究鸭坦布苏病毒，目前尚未见有关鸭坦布苏衣壳蛋白表达方面的研究。另一方面，众多研究者对病毒衣壳蛋白进行了大量的研究，刘忠钰等已研究发现衣壳蛋白除形成核衣壳结构外,还涉及病毒RNA复制、病毒与宿主的相互作用等方面的功能[2]。许慧雯等表达及纯化了九种冠状病毒核衣壳蛋白的原核[5]。黄莉等对SARS-CoV 核衣壳蛋白表达方法的研究进展进行了综述[6]。熊炜等试验研究了猫传染性腹膜炎病毒核衣壳蛋白的表达及间接ELISA法的建立[7]。这些研究主要是从核衣壳蛋白的表达方面研究各种病毒。3.应用前景国内目前对鸭坦布苏病毒的研究重在对E蛋白的研究，而对鸭坦布苏病毒的C蛋白研究相对而言比较少。因此本课题从核衣壳蛋白的原核表达角度出发，研究分析鸭坦布苏病毒，旨在为鸭坦布苏病毒的抗体制备及疫苗的制备等方面提供理论依据，从而更好地预防鸭坦布苏病毒病。4.参考文献[1]董嘉文，孙敏华，李林林等 鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达及其免疫原性研究 动物医学进展，2014，35(2)：33-36[2]刘忠钰，秦鄂德 黄病毒衣壳蛋白研究进展 解放军医学杂志 2009，34(6) ：795-796[3]柴顺秀，马花，韩英等鸭坦布苏病毒E蛋白主要抗原区域的原核表达与鉴定 动物医学进展，2013，34(7)：49-53[4]潘异哲，万春和，黄瑜等 禽坦布苏病毒NS1基因的原核表达 福建农业学报 2013，28(7)：644-647[5]许慧雯，王彦斌，吴 超等 九种冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及纯化 基础医学与临床 2009，29(5)：499-503[6]黄莉 SARS-CoV 核衣壳蛋白表达方法的研究进展 国际检验医学杂志 2014，35(11)：1455-1458[7]熊炜，林颖峥，王艳等 猫传染性腹膜炎病毒核衣壳蛋白的表达及间接ELISA法的建立 中国动物检疫 2014，31(2)：67-70[8]黄欣梅，李银，赵冬敏等 鹅黄病毒囊膜蛋白的原核表达及抗原性分析 华北农学报 2012，27（5）：33-37[9]韩凯凯，黄欣梅，李银等 鹅新型坦布苏病毒囊膜蛋白的二级结构与B细胞表位预测 江苏农业科学 2014，42（6）：166-169[10]郑鸣，王老七，边传周等 猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株ORF4的克隆及原核表达 河南科技学院学报 2014，42（4）：52-55，61

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标我国是一个养鸭大国，而鸭坦布苏病毒对我国的养鸭行业产生了重大威胁。通过研究鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达，掌握核衣壳蛋白对鸭坦布苏病毒的功能作用，从而为鸭坦布苏病毒的抗体制备及疫苗的研究等方面提供理论依据，更好地预防鸭坦布苏病毒病。2.研究的内容（1）鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白基因的克隆；（2）鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白原核表达载体的构建；（3）鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的诱导表达及表达条件的优化。3.拟解决的关键问题扩增获得鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白并进行原核表达，为抗血清的制备以及鸭坦布苏病毒的检测奠定基础。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及实验方案（1）引物设计与合成根据鸭坦布苏病毒JS804株核衣壳蛋白基因序列，设计PCR扩增引物并引入酶切位点。（2）病毒RNA提取及RT-PCR扩增目的片段利用RNA提取试剂盒提取总RNA，利用AMV反转录成cDNA，进行PCR反应，获得鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，利用凝胶回收试剂盒切胶回收目的条带。（3）核衣壳蛋白基因的克隆和测序将目的条带与pMD18-T载体连接后，转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定为阳性的质粒送南京金斯瑞公司测序，测序结果通过NCBI在线比对分析。（4）重组表达载体的构建与鉴定用限制性内切酶酶切上述质粒，切胶回收相应片段后，用T4 DNA连接酶将目的片段与原核表达载体连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌，经双酶切鉴定筛选阳性菌。（5）重组质粒在大肠杆菌中的表达将带有重组表达载体的阳性菌按比例接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，37℃ 振荡培养至OD600 =0.4~0.6，加入IPTG，进行诱导表达，分别收集诱导表达后不同时间的菌液进行SDS-PAGE分析。（6）重组蛋白表达条件的优化按（5）中方法接种阳性菌后分别加入不同浓度的IPTG进行诱导表达，收集诱导表达后不同时间的菌液进行SDS-PAGE分析，以确定重组蛋白表达的最优条件。2.技术路线见附件3.可行性分析原核表达是迄今研究最为成熟、应用最为广的一种表达。本次实验需要技术均为常规分子生物学实验技术。所在的实验室,具有多年的分子生物学实验研究基础,具备实验所需的一切条件。综上所述,本实验具有可行性,可望达到预期目标。

4. 研究创新点

国内目前对鸭坦布苏病毒的研究重在对E蛋白的研究，而对鸭坦布苏病毒的N蛋白研究相对而言比较少。因此本课题从核衣壳蛋白的原核表达角度出发，研究分析鸭坦布苏病毒，旨在为鸭坦布苏病毒的抗体制备及疫苗的制备等方面提供理论依据，从而更好地预防鸭坦布苏病毒病。

5. 研究计划与进展

2015年3月2日3月15日 收集资料、确定选题，并网上申报课题2015年3月16日3月20日 通过课题审核，撰写开题报告，并网上提交2015年3月21日5月20日 开展实验研究，记录数据，整理资料2015年5月21日5月31日 论文撰写，形成论文初稿 2015年6月1日6月5日 询问指导老师意见，对论文进行修改完善2015年6月6日6月10日 论文最后修改定稿，答辩