OmpT和OmpF的原核表达及多克隆抗体的制备开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

ompt(outer-membrane proteases t)和ompf( outer-membrane proteases t)都是大肠杆菌最重要的外膜蛋白。

ompt可以降解抗菌肽[1]，ompt 具有特异性切割肽链某些位点的能力，可以将某类蛋白( 或多肽) 切割成多个肽段使得这类蛋白( 或多肽) 失活或者被降解成一种新的具有一定生物活性的多肽[2]。

ompf形成的离子通道是大肠杆菌与外界进行物质交换的重要通道[3]，允许不超过600 da 的小分子水溶性物质通过细胞膜，也是抗生素进入细胞的主要通道[4]。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标：原核表达ompt和ompf基因及其表达蛋白活性的检测；抗ompt和ompf蛋白抗体的制备和ompt和ompf蛋白免疫原性进行测定。

二、研究内容：1、以大肠杆菌基因组dna 为模板，设计引物，pcr 扩增ompt和ompf 基因2、将ompt和ompf 基因与pet28a 载体构建重组质粒(pet-ompt和pet-ompf)3、将重组质粒pet-ompt和pet-ompf转入bl21中进行表达4、两种质粒转化入bl21均以包涵体形式大量表达，纯化蛋白5、将原核重组表达纯化的ompt (rompt)和ompf (rompf)蛋白免疫兔子6、对抗体的免疫原性进行测定三、拟解决的关键问题：1、要将实验所设计到的片段进行pcr扩增，并连接到载体上。

2、确保重组质粒的高效表达及纯化3、对抗体效价的测定

3. 研究的方法与方案

一、研究方法：本实验主要使用的研究方法是重组载体的构建以及多克隆抗体的制备。

二、技术路线和实验方案：1、以大肠杆菌基因组DNA 为模板，设计引物，PCR 扩增OmpT和OmpF 基因2、将OmpT和OmpF 基因与pET28a 载体构建重组质粒(pET-ompT和pET-ompF)3、将重组质粒pET-ompT和pET-ompF转入BL21中进行表达4、两种质粒转化入BL21均以包涵体形式大量表达，纯化蛋白5、将原核重组表达纯化的OmpT 蛋白(rOmpT)和OmpF 蛋白(rOmpF)免疫兔子6.、对抗体的免疫原性进行测定三、可行性分析：本实验用的禽致病性大肠杆菌和各种所需的材料在实验室有保存，目前实验室已有重组质粒和蛋白表达成功的各种先例，师兄师姐提供了技术指导和宝贵的经验为此次实验的进行奠定了良好的基础。

4. 研究创新点

特色或创新之处大肠埃希菌血清型众多，地域性较强，耐药性突出，感染率较高，严重影响养殖业的发展。

目前，对于大肠杆菌病的防治主要是使用抗生素和疫苗，但是全菌灭活E.coli疫苗的免疫原性不强，本实验研究rOmpT和rOmpF的免疫原性，为创建亚单位疫苗提供实验依据。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2015.3.1---2015.3.10：培养大肠杆菌，提取基因组；设计引物。

2015.3.11---2015.3.25:ompt和ompf 基因原核表达载体pet-ompt和pet-ompf的构建。

2015.3.25---2015.4.12: ompt和ompf 基因表达蛋白的检测。