两株H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及对鸡致病特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

禽流感病毒（avian influenza virus，aiv）变异频繁，血清型众多，已在全世界范围内广泛地流行。基于血凝素（ha）和神经氨酸酶（na）表面抗原，目前已发现16种ha亚型和9种na亚型。1966年，首次在美国威斯康辛州的火鸡中分离到h9n2亚型禽流感病毒^[1]。在中国大陆，1994年陈伯伦等^[2]首次从广东某鸡场发病鸡体内分离到6株h9n2亚型禽流感病毒。香港大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位发表的监测数据显示，h9n2亚型流感病毒在我国持续流行，且宿主范围广泛，包括鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑等^[3]。h9n2现今已成为我国禽类养殖中，危害较大的一种传染病。2013年以来，在我国发现的新型h7n9亚型和h10n8亚型病毒，其内部基因均来自h9n2亚型病毒。h9n2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒，在养殖环境下，可引起鸡呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状，当继发细菌感染时，可引起部分病鸡的死亡。试验条件下接种spf鸡，一般不表现临床症状，或表现出轻微的临床症状，通常不能引起明显的组织病变^[5]。目前，已有研究统计分析了近些年来临床分离的h9n2亚型禽流感病毒，结果发现，部分分离株对鸡和鸡胚的致病性显著增强。强致病力毒株在鸡体内复制力强、排毒时间长，且可以造成鸡系统性感染，接种鸡胚后，能够致死鸡胚^[4]。这种强致病力h9n2毒株的出现，对于养禽业和公共卫生均构成威胁。本实验选取2份来自山东两个地区临床发病鸡组织接种鸡胚后收获的尿囊液，分离病毒进行全基因组序列分析，并测定了这两个毒株的对spf鸡致病指数，体内的复制和排毒情况以及在鸡之间的传播能力，以探究h9n2亚型毒株致病力是否增强。

h9n2亚型禽流感病毒不仅在禽类中广泛流行，部分毒株还能跨越种间屏障继而感染哺乳动物，对我国的公共卫生安全和人类的健康造成巨大的威胁。1998年6至8月，广东省汕头市和韶关市先后从9明流感样病例中分离出h9n2亚型禽流感病毒。这也是全球首次发现h9n2禽流感病毒感染人的病例。1999年3月，香港也发生两例h9n2亚型禽流感病毒感染人的事件^[6]。近年来，人的血清学调查结果显示感染h9n2亚型禽流感的人数已经远远超过确诊的h9n2亚型禽流感病例，尽管还没有血清学证据表明该亚型病毒可以在人体内可以建立稳定的体系，但可以看出该亚型病毒已经跨越了人-猪的种间屏障，应高度重视其在人群中流行的潜在可能性。

h9n2亚型禽流感病毒不仅能够直接感染哺乳动物，还可以作为基因供体参与其它亚型流感病毒的重排，从而获得感染人类的更强毒力，继而对人类造成更大的威胁。2003年有两名香港人感染h9n2亚型禽流感病毒，其内部基因与1997年从人体分离的h5n1亚型禽流感病毒有着高度的同源性。该病毒也被认为是h5n1亚型禽流感的基因供体。2013年在我国发生的h7n9亚型流感病毒，在12个月内即造成336人感染，而h5n1在10年内对人的感染病例总和为650例。经研究证实，该病毒全部的内部片段均源自h9n2亚型禽流感病毒。同年在江西发生的h10n8亚型禽流感病毒感染人的事件，该病毒的全部内部基因亦源自h9n2亚型禽流感病毒^[7]。因此，加强对h9n2亚型禽流感病毒的流行病学调查和监控，对我国动物流感和人间流感的预警和防控意义重大。

2. 研究的基本内容和问题

目标

从三份临床发病鸡的组织病料中分离h9n2病毒，通过对其基因序列分析及对鸡致病性研究，判断其是否出现毒力变异，对鸡的致病性是否增强。

内容

3. 研究的方法与方案

方法

1. 鸡胚分离法进行猪流感病毒分离培养：鸡胚由于其敏感性高、操作方便，siv一般都能够在9～11日龄鸡胚上增殖。孵化器内培养2天，无菌收集鸡胚尿囊液做血凝实验（ha），如阳性则收取尿囊液；若为阴性，传代1次，还为阴性则弃去。

2. 血凝试验（ha）：流感病毒粒子表面的血凝素蛋白（ha）具有识别并与某些动物包括鸡、豚鼠、绵羊、马和人o型血红细胞受体特异性结合的特性，血凝试验就是根据以上原理提出来的，ha试验易于操作、方便、耗时短，因此常用于检测细胞或者鸡胚尿囊液培养物中的流感病毒。

4. 研究创新点

本实验通过对三份临床发病鸡的组织病料中分离H9N2病毒，通过对其基因序列分析及对鸡致病性研究，判断其是否出现毒力变异，对鸡的致病性是否增强。以探究、H9N2病毒的基因特征，进而为解析导致H9N2特性变异的分子基础提供基本数据，为H9N2流感病毒在鸡群中的监测以及防制提供参考依据，为探究其对哺乳动物的致病力是否增强打下基础。

5. 研究计划与进展

（1）2015.4.112015.4.20从三份h9n2病毒尿囊液提取rna，使用通用引物rt-pcr，扩增全基因8个片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，条带阳性者送入公司测序；阴性则优化实验条件，重新扩增，至获得完整分离毒株片段。整理获得的毒株全基因序列，分析突变位点，下载参考序列并绘制进化树。

（2）2015.4.212015.4.30 鸡胚接种送检尿囊液繁育病毒，血凝及血凝抑制试验重新鉴定。鸡胚半数感染量（eid50）和组织细胞半数感染量（tcid50）测定，对病毒进行定量。

（3）2015.5.12015.5.20 对6周龄spf鸡进行感染实验和静脉接种指数（ivpi）的测定。在鸡胚成纤维细胞（cef）上进行病毒生长曲线的测定。