利用CRISPR/Cas9敲除马链球菌兽疫亚种GTP连接蛋白基因开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

目前世界范围内还未有人以人畜共患细菌为研究对象，用crispr/cas9系统进行基因编辑或敲除。

猪链球菌2型是一种人畜共患病，其爆发曾造成多人死亡，利用cas9进行基因编辑或敲除可以有效的提高细菌的研究效率，并有望制作基因缺失疫苗。

主要文献：1.one-step high-efficiency crispr/cas9-mediated genome editing in streptomyces2.rna-guided editing of bacterial genomes using criscriscriscrispr-cas systems3.identification-and-characterization-of-putative-virulent-genes-in-streptococcus-equi-ssp-zooepidemicus4.马链球菌兽疫亚种毒力因子研究进展_贺名

2. 研究的基本内容和问题

目标：掌握分子克隆基本操作，独立完成质粒的设计和构建内容：构建能够表达sgRNA和Cas9的质粒，并将其转进细菌，验证其效率关键问题：能否成功构建能够表达sgRNA和Cas9的质粒，细菌能否转入两种不同质粒并表达，细菌中NHEJ和HR修复机制对Cas9敲除的影响

3. 研究的方法与方案

构建能够表达sgRNA的质粒构建能够表达Cas9的质粒现将猪链球菌2型做成感受态，电转表达Cas9的质粒，抗性筛选后，单克隆扩增一代，再将其做成感受态，筛选后进行T7EN1实验，验证效率

4. 研究创新点

世界范围内还未有人以人畜共患细菌为研究对象，该方法如果成功可大大提升细菌研究的效率。

有望高效率的制作基因缺失疫苗。

5. 研究计划与进展

早期，阅读文献，掌握分析克隆的基本技术，熟练构建载体中期，构建能够表达sgRNA的质粒，构建能够表达Cas9的质粒后期，感受态制作，电转质粒，T7NE1酶切验证