展示EV71中和表位SP70的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）手足口病（h,foot mouth disease,hfmd）是由肠道病毒引起的传染病，该病多发生于5岁以下儿童，主要临床表现为口痛、厌食、低热和手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。

个别重症患儿病情发展快，导致死亡[1]。

从20世纪80年代开始，越来越多的报道针对手足口病在全球范围内的发生情况，这也成为了世界公共卫生组织面临的一个新挑战。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标：运用体外重组的方法将肠道病毒71型（ev 71）结构蛋白vp1上的中和表位sp70以三个串联的形式克隆到黑猩猩腺病毒68型（adc68）的纤维蛋白（fiber）区域上，以期获得一种新型的以改装后腺病毒为载体并能有效对抗ev71的疫苗形式， 为后续动物试验奠定基础。

2.2研究内容： 1、 运用三个串联的sp70片段克隆到腺病毒的fiber区域上对载体进行改装； 2、 将改装后的病毒转染细胞进行包装； 3、 将包装成功的病毒进行扩大培养； 4、 纯化病毒：氯化铯密度梯度离心法进行超高速离心纯化； 5、 鉴定：运用elisa或者等手段检测sp70表位是否成功展示在adc68的纤维蛋白（fiber）上 2.3拟解决的关键问题 1、目的片段与载体体外连接的方法 2、质粒抽提与纯化的方法。

3、hek293 细胞培养和传代 4、运用人工脂质体法体外将线性化的质粒dna转染至细胞系。

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法：本课题采用实验室常用实验方法和操作进行新型腺病毒载体的构建和鉴定，具体包括分子克隆的一系列步骤包括质粒dna体外酶切，酶切片段体外连接进行重组分子的构建，重组dna分子的转化、重组克隆的筛选、琼脂糖凝胶电泳酶切产物进行鉴定以及细胞培养及传代，质粒抽提，病毒转染细胞，氯化铯酶联免疫吸附实验(elisa)、蛋白质印迹法（western blot）等方法。

3.2实验方案 1、酶切及重组载体的构建用pme i限制性内切酶酶切padc68载体，与串联的三个sp70片段进行体外同源重组构建新的载体； 2、转化及细菌培养将连接产物加入大肠杆菌感受态细胞中，经过热激、冷激和摇床孵育后涂布于lb氨苄培养基上进行10-24h培养。

挑取阳性克隆接种于5ml tb培养基中，30℃培养12h后，将阳性克隆菌液送至公司测序。

4. 研究创新点

对腺病毒的纤维蛋白（fiber）区域通过体外克隆连接多肽SP70进行改装后以期构建新载体下的EV71疫苗。

5. 研究计划与进展

2015.3.2-2015.3.10 目的基因片段与载体连接 2015.3.11-2015.3.15 转化及细菌培养 2015.3.16-2015.3.19 质粒的抽提 2015.3.20.-2015.4.10 病毒包装 2015.4.11-2015.4.25 病毒扩增 2015.4.25-2015.5.1 纯化病毒 2015.5.2-2015.5.10 ELISA或western blot试验 2015.5.11-2015.5.20 数据整理及毕业论文撰写