结核分枝杆菌RbpA蛋白功能域研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

肺结核（tuberculosis,tb）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，mtb）引起的严重危害人类健康的慢性传染病。

近年来，结核分枝杆菌菌株耐药性的出现给肺结核的化学治疗带来了巨大阻碍，寻找新型抗结核药和药物作用新靶点是当前研究热点。

rbpa是发现于天蓝色链霉菌的一种rna聚合酶结合蛋白，这种蛋白作用于rna聚合酶β亚基，过表达msrbpa能够增强耻垢分枝杆菌对利福平的耐药性[1]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目的 阐述结核分枝杆菌rbpa蛋白不同结构域的功能。

2.研究内容该项目建立在本实验室的前期研究基础之上，即成功构建rbpa野生型pmv-261质粒（含有以下主要元件：受诱导剂调控的启动子、大肠杆菌复制子、耻垢分枝杆菌复制子、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因），并且试验验证，在诱导剂存在下，转化该质粒的耻垢分枝杆菌不能正常生长。

其中，诱导剂为脱水四环素（anhydrotetracycline，atc），当atc达到800 ng/ml时，rbpa将被完全敲降。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及技术路线（1）设计引物（2）pcr（3）核酸电泳（4）dpn i消化pcr产物（5）转化感受态（6）克隆筛选（7）提取质粒（8）测序并对比（9）电击转化感受态耻垢分枝杆菌（10）接种培养（11）质粒鉴定和菌液转接（12）划线培养，观察生长情况2.实验方案（1）引物设计使用软件primer5.0设计一对含有预期突变点的引物，并送公司合成。

（2）引物稀释引物粉末首先13000 rpm 离心3 min，再按照引物单上面的提示加相应体积的ddh2o稀释成100 μm的母液。

工作液一般为10 μm，配20 μl工作液则取2 μl母液加18 μl ddh2o。

4. 研究创新点

本研究使用quikchange ii xl site-directed mutagenesis kit实现目的基因的突变。

quikchange ii xl site-directed mutagenesis kit由于巧妙设计，使得质粒定点突变技术便得简单有效。

设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用pfuturbo聚合酶循环延伸。

5. 研究计划与进展

研究计划：2015.3.2-3.8：查阅文献，阅读资料，了解课题背景知识。

2015.3.9-3.15：学习分子克隆基本操作步骤，设计引物。

2015.3.16-4.19：找到合适的含有突变位点的引物和合适的扩增条件对目的片段进行突变。