PRRSV毒株的分离鉴定及遗传演化分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv）引起的一种传染病，俗称蓝耳病。

此病以发病母猪流产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍,以及各年龄猪(特别是仔猪)发生呼吸道症状和高死亡率为特征。

2006我国爆发了高致病性猪蓝耳病，随后在我国南方多个省市蔓延，造成严重的经济损失。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标对一株疑似prrsv毒株进行分离鉴定及序列分析。

内容查阅收集文献资料，熟悉相关研究内容。

制定研究方案、试验方法。

3. 研究的方法与方案

研究方法rt-pcr，病毒marc-145细胞培养、免疫荧光、病毒rna的抽提、特定区域的扩增和测序、病毒学特性分析（空斑、生长曲线等）技术路线 病料的pcr/rt-pcr检测 阳性病料病毒的分离 病毒鉴定（基因组复制、转录、蛋白的翻译、空斑形态、生长曲线）主要基因片段的序列分析（nsp2、gp5）实验方案1.病料的采集与处理2.病料的总rna、dna的提取3.进行prrsv、csfv、pcv2的pcr、rt-pcr扩增4.取pcr产物，用10g/l琼脂糖凝胶电泳，进行分析5.将阳性组用marc-145细胞进行病毒的传代、分离6.将阳性病料混悬液接种于marc-145细胞进行增殖7.对第5代病毒分离物进行prrsv的rt-pcr、ifa检测8.引物设计，nsp2、gp5基因的扩增9.rt-pcr产物的鉴定，回收cdna片段并与t载体连接10.连接产物的转化11.重组质粒的提取，pcr鉴定，酶切鉴定12.重组质粒的测序分析13.得出结论可行性分析 1. 本研究大多数的研究方法与技术已经成熟，并且可以在本所中心实验室及本研究室进行。

prrsv的检测方法、细胞培养、后续的病毒学特性检测、病毒复制、转录水平的检测方法都已经建立并相当成熟。

2. 本实验室经过多年的发展，已具备开展分子病毒学、动物传染病学、分子生物学、细胞生物学及动物实验的基本条件，拥有本项目相关的基本实验仪器。

4. 研究创新点

对新近猪场流行的PRRSV进行分离鉴定，并对变异区进行基因扩增、测序、分析，对了解目前的高致病性PRRSV流行态势、在现有疫苗免疫压力下的病毒变异有一定的了解，对于明确我国当前PRRSV毒株的分子流行病学特征有重要意义。

5. 研究计划与进展

2015年3月份，进行课题设计、开题报告的撰写，实验方法技术的熟悉掌握。

2015年4月份，进行病毒的分离、病毒的培养、传代、病毒特定基因区的扩增，序列比对、病毒复制转录水平的分析、病毒学特性分析。

2015年5月份，分析实验数据，撰写毕业设计。