猪源OASL抗日本脑炎病毒活性的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

流行性乙型脑炎，是由日本脑炎病毒（japanese encephalitis virus, jev）引起的一种严重的人畜共患虫媒病毒性传染病。jev属于黄病毒科(flaviridae)黄病毒属(flavirus)，为单股正链rna病毒。日本乙型脑炎为最常见的病毒性脑炎，是一种中枢神经系统的急性传染病。该病具有严格的季节性和一定的地理分布，多发生于蚊虫较多的夏秋季节，以三带库蚊为主要传播媒介。猪被认为是其最重要的自然增殖动物，被感染的怀孕母猪常发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎。人对jev易感，成年人多为隐性感染。青少年及儿童由于血脑屏障尚未发育完全，极易形成病毒性脑炎，病死率高。在我国，日本脑炎病毒不仅给养猪业造成巨大经济损失，而且严重威胁人畜健康^[1,2]。

2-5 寡腺苷合成酶是一种干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，是哺乳动物先天性免疫系统的重要成分^[3]。人的oas基因已被证实与西尼罗病毒(wnv)、丙型肝炎病毒(hcv)和sars冠状病毒的易感性有关^[4]。有研究表明人oas1能抑制脑心肌炎病毒(emcv)的增殖 ^[5]。

oas蛋白家族经典抗病毒途径是依赖核糖核酸内切酶 l（ribonuclease l , rnase l）的作用。oas蛋白的酶活性中心位于n端结构域和c端结构域的连接处，并由两结构域的部分残基组成，这些氨基酸残基结构具有高度的保守性，它们决定oas蛋白酶类的催化活性。在ifn作用下，细胞合成大量无活性的oas，经病毒的双链rna激活oas而具有催化活性，以atp为底物，催化合成2-5 寡腺苷酸（2-5 a），2-5 a特异性结合并激活rnasel降解病毒的mrna 以及细胞的rna，从而发挥抗病毒作用^[6,7]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标和内容

pk-15细胞经ifn-β，产生oasl不同剪接体，分别是全长为1047bpoasl完整的片段和产生缺失外显子4的815bp的片段。本实验拟构建oasl两种不同剪接体的真核表达载体（pflag-oasl1，pflag-oasl-d4），并瞬时转染pk-15细胞后，通过实时荧光定量pcr (quantitative real-time pcr)、蛋白免疫印迹（western blotting）等实验方法检测病毒蛋白的变化，以此来检测oasl不同剪接体抗jev的活性。

拟解决的关键问题

oasl不同剪接体真核表达载体的构建，真核表达载体瞬时转染pk-15细胞以及抗病毒活性检测。

3. 研究的方法与方案

研究方法

本实验拟采取pcr技术、构建真核表达载体技术、病毒转染细胞技术以及病毒基因组分析、western blotting、实时荧光定量pcr等技术来探讨对猪oasl抗日本脑炎病毒的的活性。

技术路线及实验方案

[1]根据ncbi(national center of biotechnology infmation)上得到oasl序列，设计引物。

4. 研究创新点

因为猪OASL的抗病毒机制尚无明确报道，本实验为研究其抗病毒机制奠定基础。

5. 研究计划与进展

2015.03.02~2015.03.15 毕业设计课题选材、学习实验基本操作

2015.03.16~2015.03.20 确定毕业设计课题学习与之相关的实验理论知识

2015.03.21~2015.03.31 完成引物设计，进行真核表达载体的构建，完成开题报告