肠出血性大肠杆菌O157:H7遗传标志性基因Z3276荧光定量PCR方法的建立与应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

（一）研究意义肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic e. coli，ehec）o157:h7 是常见的肠道致病菌，感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达 5%～10%[1]。

1982年，riley 等报道了由 ehec o157:h7 引起的出血性结肠炎的暴发流行，这也是把ehec o157:h7 确认为严重致病菌的首次报道[2]。

随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行[3]。

2. 研究的基本内容和问题

（一）项目研究的目标建立定量检测肠出血性大肠杆菌O157:H7遗传标志性基因Z3276的qPCR方法，对临床分离的疑似肠出血性大肠杆菌进行Z3276基因定量检测。

（二）研究的内容1.引物设计及合成2.PCR扩增和定量用标准品的制备 3.实时荧光定量PCR条件的优化4.重复性、特异性和敏感性实验5.标准曲线的绘制6.模拟阳性样品处理和模板制备7.临床样品的检测（三）拟解决的关键问题1.实时荧光定量PCR条件的优化2.标准曲线的绘制

3. 研究的方法与方案

（一）研究方案1.引物设计及合成根据genbank上发表的ehec o157:h7 edl933（登录号：ae005174）z3276基因序列设计引物和探针。

2.pcr扩增和定量用标准品的制备pcr 产物回收纯化后连接到 p md19- t 中 ，转化 dh5α，筛选阳性重组质粒，提取重组质粒，用核酸蛋白检测仪测定 d260和 d280值，计算核酸浓度并进行纯化，10 倍倍比稀释，分别选取 10^2～10^8等 7个不同稀释度的阳性质粒作为标准品模板。

3.实时荧光定量pcr条件的优化采用taqman探针法，在荧光定量pcr仪上进行扩增和数据分析。

4. 研究创新点

常规 pcr中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对pcr扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒 dna/rna 的精确拷贝数等，如此，荧光定量 pcr 技术便应运而生。

常规 pcr中，pcr产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规 pcr只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析；荧光定量pcr中，pcr反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使 pcr 产物的实时检测成为可能。

相对常规pcr 而言，荧光定量 pcr 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定 量 pcr 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数。

5. 研究计划与进展

2017.9~2017.10 设计用于扩增的引物、进行PCR扩增2017.10~2017.11定量用标准品的制备、实时荧光定量PCR条件的优化2017.11~2017.12标准曲线的绘制、重复性、特异性和敏感性实验2017.12~2018.1 模拟阳性样品处理和模板制备及临床采集鲜奶的检测