猪圆环病毒2型荧光定量检测与分型方法的建立及其应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒（porcine circovirus，pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，最早由tischer等[1]于1982在pk-15传代细胞系中发现，是一种小的、无囊膜的单链负股环状病毒。

allan[2]等认为可根据pcv的抗原性及核苷酸序列将其分为pcv1和pcv2两种血清型。

pcv2有较强的致病性，可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, pmws)[3]，还能引起猪皮炎与肾病综合征、猪增生性和坏死性肺炎、猪呼吸道综合征、猪先天性脑震颤、繁殖障碍等疾病[4]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：根据genbank中pcv2 d型orf2序列设计特异性引物和taqman探针，构建包含pcv2 orf2 d型基因全长的重组质粒作为标准品，优化反应条件和体系，建立针对pcv2 orf2分型的taqman荧光定量pcr检测方法。

研究内容：（1）重组质粒标准品的制备；（2）real-time pcr反应体系条件的优化；（3）荧光定量标准曲线的建立；（4）real-time pcr的敏感性、重复性、特异性试验；（5）临床样品的检测拟解决的关键问题：（1）关于pcv2的rt pcr引物设计，既要保证序列的高度保守，以防降低定量的准确性，造成假阴性，同时又要确保d型与其它亚型之间的特异性，本研究将根据genbank中登录的pcv2 d型orf2序列设计。

（2）探针设计需要高度保守，以及选择出最合适的荧光基团及淬灭基团。

3. 研究的方法与方案

研究方法：根据TaqMan实时荧光定量建立PCV2分型检测方法。

技术路线：1.制备质粒标准品2.优化RT PCR反应体系及条件3.建立RT PCR标准曲线4.RT PCR的敏感性、重复性、特异性试验5.临床样品的检测可行性分析：本研究使用的TaqMan实时荧光定量方法属于成熟常规的方法，具有可行性。

4. 研究创新点

构建了新的针对pcv2 d型的定量检测方法。

传统分型方法为对pcv2特定基因序列扩增后测序，实验周期长且操作繁琐，降低了分型效率及准确性。

利用rt pcr法更加便捷、准确、操作简便。

5. 研究计划与进展

2017.9-2017.10制备标准品:设计一对针对pcv2d orf2的特异引物扩增pcv2目的基因，连接pmd19-t载体后转入dh5α克隆。

测序并测质粒纯度和浓度，用te稀释获得质粒浓度10^1~10^10 copies/ul的标准品2017.10-2017.11优化rt pcr条件：得到r^2>0.99，扩增效率90%~110%，无模版组（ntc）未出现产物，standard曲线斜率-3.6~-3.1的条件，并绘制标准曲线2017.11-2017.12进行重复性实验、 特异性实验、敏感性实验。

2017.12-2018.1对98份猪场样品进行临床试验。