大肠杆菌Skp，MipA，Fadmt重组免疫原的构建及对小鼠的免疫保护开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大肠埃希菌俗称大肠杆菌，大多数血清型并不具有致病性，而少数大肠杆菌可引起动物和人的大肠杆菌病，是一种人兽共患的细菌病。

病原性大肠杆菌可分为产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic escherichia coli，etec）、产类志贺毒素大肠杆菌（shiga-like toxigenic escherichia coli, sltec）、肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic escherichia coli，epec）、败血性大肠杆菌（septicaemic escherichia coli，sepec）和尿道致病性大肠杆菌（uropathogenic escherichia coli，upec）[1]。

其中，etec是导致人和幼龄动物腹泻最常见的致病菌，引发仔猪黄痢、白痢等，造成猪养殖业的巨大经济损失。

2. 研究的基本内容和问题

1研究目标1.1 构建bl21/ pcoldi -hon-ig-hoc- skp、bl21/ pcoldi -hon-ig-hoc- mipa、bl21/fadmt pcoldi重组菌，表达可溶性蛋白；1.2 表达的蛋白对小鼠抗大肠杆菌具有较好的免疫保护力。

2内容2.1 skp、mipa、fadmt基因片段获取；2.2 pcoldi-hon-ig-hoc- skp、pcoldi-hon-ig-hoc- mipa、fadmt-pcoldi重组质粒构建；2.3 bl21/pcoldi -hon-ig-hoc-skp、bl21/pcoldi -hon-ig-hoc- mipa、bl21/fadmt -pcoldi重组菌构建；2.4 skp，mipa，fadmt基因诱导表达蛋白在上清、纯化；2.5 小鼠免疫试验。

3拟解决的关键问题skp，mipa，fadmt蛋白表达在上清，并以此为基础制备疫苗免疫小鼠。

3. 研究的方法与方案

1研究方法重叠延伸剪接术( splicing by overlap extension，soe)连接 hon-ig-hoc和pcoldi载体,构建pcoldi-hon-ig-hoc载体；双酶切法制备目的基因片段和载体，进而构建重组质粒；热激转化法将重组质粒转化入感受态细菌；iptg诱导大肠杆菌表达目的蛋白；离子交换层析纯化目的蛋白。

2.技术路线请看附件3.实验方案3.1 菌株大肠杆菌标准菌株c83903(o141:k85，k88ab)，江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存。

3.2菌株复苏及dna模版的制备-80℃取出标准菌株，划线含林可霉素50μg/ml的麦康凯平板，37℃温箱培养过夜，挑取单个菌落，接种于5ml含林可霉素50μg/ml的lb肉汤中，37℃摇床培养8 h。

4. 研究创新点

Skp、MipA在以往的研究当中均在细菌包涵体中具有较高表达量，本实验拟置换Skp，MipA表达载体，在载体中插入HON-Ig-HOC，以期其在上清中具有较高表达量，减少蛋白疫苗制备的繁复程序和制备成本。

本实验3个蛋白的基因序列在多个大肠杆菌血清型中保守，以期为以后广泛的大肠杆菌疫苗研制提供一定的理论依据和研究基础。

5. 研究计划与进展

2015.9.1-2015.9.30 目的基因扩增并测序；开题报告；2015.10.1-2015.10.31 重组菌构建和蛋白诱导表达、纯化；中期报告；2015.11.1-2015.11.30 动物实验；2015.12.1-2015.12.31 数据处理和论文撰写。