生物质碳量子点比率型荧光探针对环境样品中烯啶虫胺的快速灵敏检测开题报告

1.1研究背景

随着时间的推移，我们的生活日渐提高，人民安居乐业，各行各业飞速发展，与此同时，环境问题也在日趋严重，如气候变化、臭氧层的破坏、水资源短缺、生物多样性锐减等。当前，普遍引起全球关注的环境问题主要有：全球气候变化、酸雨污染、臭氧层耗损、有毒有害化学品和废物越境转移和扩散、生物多样性的锐减、海洋污染等。其中，农药污染也是当今社会环境污染的重要组成部分，农药污染具有高毒性，隐蔽性，复杂性，紧迫性等各方面的特点。农药对突然的危害极大，被农药长期污染的农田土壤会出现明显酸化；土壤养分（氮，磷，钾等）随污染程度加重而减少；土壤空隙度变小，从而造成土壤结构板结。

目前，检测环境样品中农药残留的方法有很多，例如震荡漂洗法，匀浆萃取法，索氏提取法，微波辅助萃取法，固相萃取法。除此之外，还有超声波提取方法，超临界流体萃取，衍生化技术等等。这些方法基本上都可以灵敏地检测出环境样品中农药的残留，都可以用于环境样品中农药微量和多量残留的检测。然而这些测试仪器普遍十分贵重、器材成本高、耗时较长、测试过程繁琐，难以满足日益增长的现场监测和在线分析等需求。因此，如何能够高灵敏度、高准确度且快速检测环境样品中农药残留的方法的研究，对于保护环境、保障人们生活安全有着重要意义。而荧光检测法具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、选择性好、不依赖大型仪器等优点，充分满足对环境样品中农药残留量快速检测的要求。

2004年，美国南卡罗莱纳大学的XuXiaoyou等人报道了利用电弧放电来制备单壁碳纳米管(SWCNTs)的方法，并在电泳法纯化产物的过程中首次发现了可以放出明亮荧光的碳量子点随着对于碳量子点更加深入的研究，人们在它的合成，性能和应用方面的研究都取得了很大的进展。同时，碳量子点的原料来源广泛，制备成本也比较低，在材料制备领域有很大的优势，在医学成像设备、微小的发光二极管、化学传感器、光催化反应等的很广的领域中都有较好的应用前景。

1.2 国内外研究进展

近年来，有不少研究者将研究焦点聚集于构建基于荧光分析方法的荧光探针用于小分子物质的检测分析，并且取得较好的研究成果。JinH等开发了一-种基于尿酸的酶促反应产生的H202对谷胱甘肽封端的CdTe纳米颗粒进行荧光猝灭而实 现对尿酸检测的方法，在最佳实验条件下，尿酸的检测范围为0.22-6 μM，检出限为0.10μM。Wang[21]等设计了硫氮共掺杂碳量子点高选择性荧光探针检测尿酸，合成的氮硫共掺杂碳量子点的量子产率高达73.1%,并且发现该碳量子点的荧光可以明显被H2O2与Fe2 之间Fenton反应所产生的羟基自由基猝灭,而H2O2. 的产生源于尿酸酶对尿酸的氧化，因此，开发了一种基于Fenton 反应和酶促反应检测尿酸的光学生物传感器。.上述研究中都利用荧光探针对尿酸实现了检测,但是整个过程中要有尿酸酶的参与。邓I3]等以C60为主要碳源，同时加入十六烷 基三甲基溴化铵(CTAB)、氢氧化钠以及H2O2通过水热法合成荧光碳量子点，并且在pH 7.3磷酸盐缓冲溶液中，叶酸能够猝灭碳量子点的荧光，在叶酸浓度为 0.025-2.0μM范围内，猝灭的荧光信号强度与叶酸浓度呈一定线性关系，从而实现对叶酸的检测。Mol4等开发了--种能实现抗坏血酸的高灵敏度和选择性检测 方法，所建立的方法用抗坏血酸将碘酸盐(IO3)还原为碘(I2)，产生的碘对具有荧光的溶菌酶稳定化银纳米簇具有荧光猝灭的作用,从而实现对橙汁和尿液中 抗坏血酸的检测。

1.2.1 烯啶虫胺的概述

烯啶虫胺（Nitenpyram），是一种有机化合物，分子式为C₁₁H₁₅ClN₄O₂，分子量为270.7154，相对密度1.255，熔点/凝固点82℃。可广泛应用于黄瓜、茄子、萝卜、番茄、葡萄、茶、水稻上防治各种蚜虫蓟马、粉虱、叶蝉等害虫。西啶虫胺是烟酰亚胺类，是日本继吡虫啉、啶虫咪之后开发的又一种新型产品。具有卓越的内吸性、渗透作用、杀虫谱广、安全无药害。是防治刺吸式口器害虫如白粉虱、蚜虫、梨木虱、叶蝉、蓟马的换代产品。与其它的新烟碱类杀虫剂相似，烯啶虫胺主要作用于昆虫神经系统.对害虫的突触受体具有神经阻断作用，在自发放电后扩大隔膜位差，并最后使突触隔膜刺激下降，结果导致神经的轴突触隔膜电位通道刺激消失，致使害虫麻痹死亡。

1.2.2 烯啶虫胺的检测方法

使用带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪，带碱热离子检测器或高灵敏度氮磷检.测器的气相色谱仪和气相色谱--质谱仪。

1.2.3 碳量子点在生物小分子检测上的应用

荧光探针( Fluorescence probe)是一类在紫外光照射下能发荧光，并且其荧光性质包括激发波长、发射波长、荧光强度、荧光寿命等能随所处外界环境例如粘度、极性、温度、pH等的变化而发生变化的分子。荧光探针一般由三部分组成:荧光基团( Fluorophore)、连接基团(Linker) 和识别基( Receptor)。荧光基团中一般含有共轭结构，在获得能量后发出荧光，主要负责荧光信号的输出;连接基团起到连接荧光基团和识别基团的枢纽作用，使三者成为一体，从而整个过程完整传递;而识别基团则是起到识别被分析检测物质的作用。在一定程度.上，识别基团能够决定探针的特异性与选择性，而荧光基团能够决定探针的灵敏度。

荧光探针大致包括以下几类:生物蛋白类荧光探针，有机小分子荧光探针以及纳米材料荧光探针。其中，生物蛋白类荧光探针主要有生物中最常用的绿色荧光蛋白还有红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等，这类生物蛋白探针主要用于生物成像方面。有机小分子荧光探针多以有机荧光染料及其衍生物为主，有香豆素类，芘类，喹啉类，罗丹明类，萘系物质及其它们各自的衍生物，这类有机小分子荧光探针在金属离子检测中有广泛的应用,但是因其存在激发波长范围较窄，生物毒性较大，兼容性差等缺点而使其在其它领域的应用受到一定的局限。而纳米材料荧光探针是具有纳米级结构的荧光探针，尺寸一般在1-100nm。由于其具有良好的光学性质促使其在分析检测,生物成像，以及药物治疗等方面有着广泛的应用。

1.2.4 比率型荧光探针的构建

将有机荧光探针分子中引入某一个和探针中的荧光团一起受光激发、且发射不同波长光的参比染料，得到第二个独立的信号做参比(内标),这样就可以设计内标型比率荧光探针8。这种内标式比率荧光探针参比荧光染料荧光恒定，对被分析物的识别不敏感。响应基团和参比荧光基团可通过化学共价键形式组合在-一个大有机分子中，这类探针的构建往往涉及到复杂的有机合成过程。此外还可以通过分子组装和共聚包埋的形式进入同一个体系中。这种比率荧光探针设计机理比较简单，只需要寻找合适的响应基团和参比基团，然后将两者连接即可。内标型比率荧光探针第二信息通道对被分析物的识别不敏感，并不具有开关功能。比率荧光探针的设计还可以通过激基复合物、荧光共振能量转移(FRET)等原理，当探针识别客体的时候，荧光发射在两条通道中被重新分配，从而使两个波长下的荧光强度均发生变化。

如果两个相同的荧光团彼此间的距离和位置合适，当其中一个荧光团被激发以后就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基复合物，从而生成一个新的、长波长的发射峰，与此同时，原来的单体的发射峰减弱或者消失9。适合这种原理的荧光基团多为多环芳烃，设计的关键在于目标识别分子的加入可以利用各种分子间作用力改变两个荧光团之间的距离和取向。利用这种原理，可以设计多种含有多环芳烃的有机荧光探针，实现对金属离子、有机物等多种物质的比率检测。如检测ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)的芘探针，能够呈现出激基复合物的发射峰，这是因为它的荧光团靠的太近导致的。当ATP被加入后，咪唑盐可以与ATP发.生静电作用，ATP就会嵌入在芘分子的双臂之间，从而使得这种二聚体的荧光峰消失，只会有芘单体的荧光峰出现，从而实现了比率检测。荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光团中，如果-一个荧光团(供体Doner)的发射光谱和另-一个荧光团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当距离合适时就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。如果接受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，可以观察到双发射波长。受体和供体可以通过共价结合形式设计为一个分子。如湖南大学张晓兵课题组通过多步化学合成方法，构建萘酰亚胺-喹啉、萘酰亚胺~卟啉等比例荧光探针，用于Hg2 的识别检测。使用萘酰亚胺是因它对汞离子具有荧光增强型响应，喹啉、卟啉等小分子的使用是因为它们不会对配位作用产生位阻，并且发射光谱和萘酰亚胺的吸收光谱重叠，满足分子内能量转移荧光探针的必要条件。另外-种常用的将受体和供体结合在-一起的方式是以二氧化硅粒子为基体，将能量供体包覆于二氧化硅粒子内部，将能量受体、同时也是识别基团键合在二氧化硅粒子表面构建比率荧光探针。如华南理工大学曾钫课题组将硝基苯并二恶唑基荧光染料(NBD)或量子点为能量供体荧光团包覆于二氧化硅粒子中，将汞离子识别基团罗丹明B作为受体共价结合在粒子表面，形成核壳结构的探针，利用罗丹明衍生物与Hg² 络合后的开环反应，实现对Hg² 的比率荧光检测。此外，张金龙课题组(1)将FITC和RBITC掺杂入介孔硅内部，利用FITC的pH响应性，构建了比率pH传感。

将基于FRET机理的能量受体和供给体通过共价键合的形成引入到温敏性聚合物中，可以设计基于距离调控的比率荧光探针。如Liu课题组1报道,将荧光供体NBDAE和荧光受体RhBEA聚合进入温敏性聚合物PNIPAAm中，可实现温度调控的比率荧光检测。当温度低于PNIPAAm的相转变温度时，聚合物以伸展的亲水性状态存在，此时两个荧光基团距离较远，无法形成共振能量转移体系。当温度升高时，聚合物收缩，两者距离靠近，可以引发共振能量转移，从而可以建立比率荧光技术检测外界温度的变化。若在此体系中加入对葡萄糖有特异识别作用的苯硼酸，则可以实现对葡萄糖的的比率荧光检测。此时距离的调控是由于苯硼酸对葡萄糖的特异识别拉近二者的距离。华南理工大学吴水珠教授课题组amp;apos;5]基于FRET原理，将能量供体异硫氰酸荧光素(FITC)和能量受体罗丹明B通过环糊精的定位作用将两者绑定在FRET的有效距离内，使两者发生高效能量转移，设计多种与金属离子特异结合的配体，从而使这些超分子体系表现出对特定离子的选择性识别功能，构建了Feamp;apos Hg² 等多种比率荧光探针。

比率荧光的设计除了通过双荧光团实现外，也可以由具有双发射功能的单个荧光团来完成，其设计原理多基于分子内电荷转移原理(ICT)。这种荧光探针通常在识别目标分子前后具有两个不同的基态，因而表现出两个不同波长的激发光谱。典型ICT荧光探针的荧光团应是一个强推拉电子共扼体系，其供电子部分或拉 电子部分是识别单元的一部分， 当与目标物相结合后，探针的供、拉电子能力被改变，整个发光体系的π电子结构重新分布，前后形成不同的基态，荧光光谱发射波长随之发生移动，实现比率荧光检测。大连理工大学钱旭红课题组以设计多个基于ICT蔡酰亚胺阳离子比率荧光探针用于铜离子、锌离子等检测。铜离子探针结合铜离子后减弱了共轭氮原子对荧光团的供电能力，从而引起了荧光波长的蓝移。锌离子探针与结合锌离子后能够脱去共轭氮原子.上的氢，从而使得荧光光谱和吸收光谱发生红移，实现比率检测。

1.3研究目的及意义

近些年来，随着科学技术的不断更新与发展，使得检测环境样品中农药残留的技术，有了一定的突破，并产生了很多高科技的检测技术与方法，在检测环境样品中农药残留的过程中，我们要快速地，灵敏地检测出环境样品中农药的残留。因此采用合适的检测技术，对检测环境样品中农药的残留有着是十分重要的意义。传统检测技术都存在这一定的缺陷，例如操作繁琐，操作时间长。有研究认为生物质量子点比率型荧光探针对环境样品农药检测有一定的成效。生物质量子点是一种绿色可再生的资源，其含丰富的碳原子和杂原子（如N，P，S等），是制备CODs的理想原料。生物质量子点具有独特的荧光性、光学稳定性、水溶性、生物相容性等优点。与传统金属半导体量子点和有机染料相比，碳量子点既保持了一种优异的荧光性能，又克服了光稳定性差、毒性高、制备工艺复杂等缺点。因此，使用生物质量子点比率型荧光探针对于环境样品中烯啶虫胺的检测有着十分重要的意义。比率型荧光探针相较于单荧光探针其本身受外部环境等因素的影响大大减小，可以进一步提高检测的准确性。比率型荧光传感器的出现可有效地避免单波长荧光探针的问题，在定量检测方面具有明显的优势。比率型荧光探针的构建研究是目前荧光探针领域研究趋势之一。本设计基于芦荟基氮掺杂碳量子点与铜纳米簇构成比率型荧光探针，对烯啶虫胺进行检测。

2.1 研究主要内容：

（1）以卡拉索枇杷叶片为碳源，尿素为氮源制备氮掺杂生物质碳量子点（N-CQDs）；

（2）制备谷胱甘肽封端的铜纳米簇（GSH-CuNCs）；

（3）对N-CQDs的制备条件进行优化；

（3）制备N-CQDs/CuNCs比率型荧光探针；

（4）对材料进行简单的表征；

（5）优化检测条件；

（6）对实际样品中的烯啶虫胺进行检测；

2.2 预期目标：

（1）以卡拉索枇杷叶片为碳源，尿素为氮源制备N-CQDs的最佳制备条件；

（2）成功构建对烯啶虫胺有响应的N-CQDs/CuNCs比率型荧光探针；

（3）通过傅里叶红外光谱（FT-IR）对N-CQDs和GSH-CuNCs进行表征；

（4）对检测条件进行优化，如缓冲液的pH、N-CQDs的添加量、GSH-CuNCs的添加量、反应时间、反应温度；

（5）对实际样品中的烯啶虫胺进行检测；

3.1研究方法

利用水热合成法制备氮掺杂碳量子点和铜簇；

利用控制变量法研究荧光探针用于水中新烟碱类农药检测条件。

3.2 实验步骤

（1）氮掺杂生物质碳量子点的制备

采用水热法合成氮掺杂芦荟基碳量子点（N-CQDs）。首先，将卡拉索芦荟叶片表面用超纯水清洗干净，放入真空冷冻干燥机中干燥，然后在球磨机中研磨成粉。取0.6 g芦荟粉、0.3 g尿素与35 ml超纯水混合后置于超声仪中超声10 min，将混合后的溶液转移到100 ml Teflon内衬的高温高压反应釜中，在200 ℃下反应12 h。反应结束后将反应釜自然冷却至室温。所得产物转移到两个相同的圆底离心管中，天平称量至二者重量差在0.1 g范围内。在10000 r/min的条件下离心10 min，去除大颗粒杂质，取上清液。将所得上清液用0.45 μm水相针式过滤器过滤，所得产物转移至透析袋（MWCO = 1000 Da）中进行避光透析24 h（平均6 h换一次水）。透析完成的样品再次使用0.45 μm水相针式过滤器过滤后避光保存在4℃以下的环境中以备后续使用。改变反应温度、反应时间、生物质碳源添加量和氮源添加量等条件，通过比较不同制备条件下得到的N-CQDs的荧光强度（FIs）来确定最佳制备条件。

（2）铜纳米簇（GSH-CuNCs）的制备

将10mL的还原型谷胱甘肽（L-GSH，50mg/mL）溶液滴加到10 mL CuSO4（10 mM）溶液中，在37℃下搅拌1 h。然后向混合液中滴加1 M NaOH溶液至乳白色悬浊液变成透明的浅黄色，继续在37℃下搅拌2 h，得到GSH-CuNCs。制备的GSH-CuNCs保存在避光4℃的环境中。

（3）荧光探针对水中烯啶虫胺检测条件优化

分别对缓冲液pH、N-CQDs的添加量、GSH-CuNCs的添加量、反应温度和反应时间等条件进行优化，获得N-CQDs/GSH-CuNCs比率型荧光探针对烯啶虫胺的最佳检测条件。

（4）N-CQDs 的表征

通过傅里叶红外光谱（FT-IR）对N-CQDs和GSH-CuNCs的表面官能团进行研究。

（5）N-CQDs的荧光产率

量子产率（QY）的计算。通过与硫酸奎宁标准品（0.1M H₂SO₄，QY=54%）在同一激发波长下的对比，测定制备的N-CQDs和GSH-CuNCs的QY。计算公式如下所示：

式中QY表示量子产率，I表示样品在激发波长发射光谱的峰的积分面积，η表示样品溶剂的折射率，A表示样品在激发波长处的吸光度，X和ST分别表示样品和硫酸奎宁。其中硫酸奎宁溶于0.1 M H₂SO₄（折射率η_ST = 1.33），样品溶于水（折射率η_X = 1.33）。样品在激发波长下发射光谱的峰的积分面积由Origin软件获得。样品的吸光度控制在0.05以内，防止浓度太大出现重吸收效应造成荧光猝灭。

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