小反刍兽疫病毒的分离和RT-PCR鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是FAO/OIE规定的A类烈性传染病，我国规定为一类动物疫病，是一种严重的烈性、接触性传染病，主要感染小反刍兽，尤其是绵羊和山羊，野生动物偶尔感染，未见有人感染该病的报道。该病以突然发热、精神沉郁、眼和鼻排出分泌物、口腔溃疡、呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和死亡为特征^[1]。小反刍兽疫病毒为副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，是具有囊膜的不分节段的单股负链RNA病毒。目前我国对小反刍兽疫病的研究还处于起步阶段。最近几年，随着SARS、禽流感等几次大规模国际性人畜传染病的暴发，PPR在我国周边地区的蔓延引起了国内的重视。近年来，中国检疫检验科学研究院、云南出入境检验检疫局、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心等单位开展了相关的研究，主要是以检验检疫技术为主，建立了RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸的方法和进行N、H基因的克隆和原核以及真核表达。其后又在此基础上引入了巢式PCR技术，在第一次PCR产物的基础上进行二次PCR，提高了反应的特异性。最近几年国际上在小反刍兽疫方面的研究取得了长足发展，以英国动物健康研究所、印度新德里和班加罗尔的几个研究所为代表的研究机构，先后发表了数十篇相关论文。英国科学家等公布了第一个小反刍兽疫病毒的全基因序列，并发现PPRV在核酸水平上与RPV非常相似，但在多肽结构上却更接近于DMV，这为构建感染性克隆、基因功能组学、PCR引物设计，病理学研究奠定了基础。韩国科学家于2005年，利用单克隆抗体和缺失变异株对PPRV核衣壳蛋白（N蛋白）的抗原表位进行了分析，最终确定4个抗原性区域（A一Ⅰ，A一Ⅱ，C一Ⅰ，C一Ⅱ）。有学者研究发现Marmoset B95a细胞可以代替Vero细胞来增殖PPRV。Marmoset B95a是一种E-B病毒造成的狨猴B淋巴细胞的衍生细胞系，它比一般所有的Vero细胞更利于麻疹病毒属的繁殖与分离，这对PPRV的研究是一件非常有用的工具^[2]。近几年该病在我国的周边国家频频发生，特别是我国也发生小反刍兽疫疫情，2007年7月，我国西藏发生不明山羊疫情，国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测^[3]。利用RT-PCR等方法证实其为小反刍兽疫病毒。这是我国首例确诊的小反刍兽疫疫情。2013年国家农业部报道新疆多地州发生小反刍兽疫疫情，并呈现由边境逐渐向内传播的趋势^[4]。现已严重威胁到小反刍动物的健康。因此对小反刍兽疫的研究，具有重大的现实意义。PCR方法是目前世界动物卫生组织规定的检测标准之一^[5]。该方法具有高度特异性和敏感性，已广泛用于抗原检测。本研究以小反刍兽疫病毒为研究对象，通过RT-PCR的方法，鉴定小反刍兽疫病毒。本研究能为小反刍兽疫的防控提供有效的依据及支持，为该疫苗的进一步开发利用奠定基础。

参考文献：[1] 信爱国,杨仁标,向文彬等.小反刍兽疫研究进展[J].中国预防兽医学报,2003,25(2):152-155.[2]郭凤花.小反刍兽疫研究进展[J].湖北畜牧兽医,2013,34(1):76-78.[3]王志亮,包静月,吴晓东等.我国首例小反刍兽疫诊断报告[J].中国动物检疫,2007,24(8):24-26.[4]Wang Z,Bao J,Wu X,et al.Peste des Petits ruminants Virus in Tibet,China[J].15(2):299-301[5]Choi K S,Nah J J,Ko Y J,et al.Rapid competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to pestedes petits ruminants virus[J].Clin Diagn Lab Immounol,2005,12(4):542-547

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：通过RTPCR的方法扩增病毒N基因，并结合阴性（水）和阳性（小反刍兽疫疫苗）对照，最后通过基因测序鉴定是否是为小反刍兽疫病毒。

研究内容：(1) 小反刍兽疫的细胞传代培养。（2）RTPCR扩增小反刍兽疫病毒N基因。（3）N基因表达的检测与鉴定。拟解决的关键问题：1：细胞分离培养需要精细的操作，确保无菌。2：小反刍兽疫病毒的RNA提取是本课题的关键问题。3：RCR的循环条件的优化。4：在PCR中可能会遇到非特异性扩增和拖尾等问题。

3. 研究的方法与方案

研究方法：1. 病毒基因组RNA提取 2. 反应体系及反应程序 3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶电泳

技术路线：实验室已拥有的病料→接种于敏感细胞→细胞传代培养→细胞发生病变→提取RNA→转化为cDNA→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→基因测序鉴定

可行性分析：用普通RT-RCR的方法鉴定小反刍兽疫病毒已运用的比较成熟，本实验室已形成一套成熟的技术路线与完善的设备，试验技术上完全可行。

4. 研究创新点

目前国内关于小反刍兽疫病毒分离鉴定的报道比较少，本研究对小反刍兽疫病例进行病毒分离和鉴定，能为小反刍兽疫的防控提供有效的依据及支持，为该疫苗的进一步开发利用奠定基础。

5. 研究计划与进展

（1）2014.3 熟悉操作，查阅文献资料，完成开题报告。（2）2014.4 小反刍兽疫病毒的分离、鉴定。（3）2014.5 撰写毕业论文，准备答辩。